摘要：為了研制無污染，無毒、副作用的綠色飼料添加劑，選擇了馬錢科植物――鉤吻作材料進行了以下研究。①提取了活性成份――生物堿；②研究它對動物的毒性和無毒性劑量；③研究了它對動物的毒性機理和病理；④進行了它對動物免疫功能和對血液學(xué)影響的研究；⑤研究了它的促生長作用及其機理；⑥還進行了殘留及臨床增重試驗研究。
關(guān)鍵詞：鉤吻活性成份毒性促生長添加劑
ResearchandUtilizationofGelsemiumelegansbenth
YuanhuiWenlixingJiangzhenyun
(AnimalscienceandtechnologycollegeofHunauAgriculturalUniversity,changsha,410128)
Abstract：Todevelopanapinoidfeedadditivewhichispollutionfree、avirulent、andsideeffectfree,thegelsemiumelegansbenth,avegetationofloganiacease,ischosentoperformseveralstudiesthereinafter；①extractactiveingredient――alkaloid；②studyitsvenenousandavirulentdosage；③studyitsvenenosmechanismandpathology；④analyzeitseffectonimmunologicfunctionandhaematology；⑤investigateitsgrowth-promotionandmachanism；⑥doresearchonresidueandweightincrementinclinic.
Key：Gelsemiumelegansbenth；ativeingredient；toxicity；growth-promotionadditives
隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼料生產(chǎn)量年年攀升，全國每年生產(chǎn)全價飼料達到6000萬噸，因而飼料添加劑量逐年增加，尤其是促生長添加劑品種繁多，例如高砷、高銅、高硒等礦物質(zhì)元素添加劑，“瘦肉精”等激素添加劑，喹乙醇、抗菌素添加劑，從而造成砷、銅、從動物糞便排出至土壤→植物→動物往復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致環(huán)境污染。有的則通過飼料―肉食品等食物鏈進人體內(nèi)，引起人的過敏，應(yīng)激，心臟病和繁殖障礙，對人的健康帶來諸多危害。
為了保護生態(tài)環(huán)境，保護人類的身體健康，研制無污染、無毒、副作用的綠色飼料，實屬必要。從1999年開始從植物中尋找既具有促生長作用，又無殘留毒性的綠色飼料添加劑。在這種背景條件下，我們在翻閱大量文獻資料和篩選的基礎(chǔ)上，選擇了鉤吻這一在南方諸省生長量較多的植物為材料進行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下：
1．鉤吻及其生物堿的資料調(diào)查，我們查閱了大量資料，獲得：
1.1鉤吻的生態(tài)分布：鉤吻，別名：斷腸草、毒根、胡蔓藤、野葛，屬馬錢科植物，纏繞常
綠藤本（見圖），主產(chǎn)于亞洲和北美。在中國主要分布在廣西、云南、貴州、湖南、福建、
江西及浙江等地。在湖南，我們經(jīng)民間調(diào)查和地考察，鉤吻主要分布在郴州、永州、湘西等地。
1.2鉤吻的民間應(yīng)用情況：《本草綱目》曾載，“斷腸草”人誤食其葉者致死，而羊食其則大肥。豬羊食其葉不但無毒，而且還令其毛澤光潤，增肥和防瘟之效�！稄V西中藥志》記載：“當豬胃納不良時，用鉤吻飼喂，能增加食欲”。
《廣東中獸醫(yī)常用草藥》記載，“鉤吻可治牛羊腸炎”，該省養(yǎng)殖戶定期給牛羊服用本植物，且有健胃、殺蟲、快肥之效。據(jù)調(diào)查，民間有人采用60g鉤吻/d給豬飼喂，僅喂3-5d后見豬食欲猛增，食飽即睡的效果�？傊�，江西、福建、廣東、廣西民間均有用鉤吻喂豬的記載。
2．鉤吻生物堿的提取、分離、鑒定及毒性劑量研究
2.1鉤吻生物堿的提取、分離和鑒定
采用95%乙醇提�。�100℃水浴回流）和氯仿（65℃回流）提取方法對鉤吻生物堿進行了提取。采用薄層層析、柱層折分離，紫外掃描圖譜比較的鑒定方法進行了鑒定。研究結(jié)果表明，醇提取方法較好，能實際應(yīng)用。從廣西玉林市郊采集的鉤吻，經(jīng)鑒定主要含有兩種單體，一種為毒性最重的鉤吻素子（koumine），另一種為植物中含量最多的鉤吻素甲（Gelsemine）。[FS:PAGE]
2.2鉤吻堿對動物的毒性及毒性、與無毒性劑量研究
將鉤吻總堿提取物配成10mg/ml的溶液后進行小白鼠的LD50測定和亞慢性毒性試驗，并觀察其毒性劑量反應(yīng)。
結(jié)果表明，鉤吻總堿的ip小白鼠，其LD50為7.38mg/kg體重，LD50的95%可信限范圍為6.76mg/kg-7.94mg/kg。亞慢性毒性試驗結(jié)果表明；1/50LD50，1/25LD50和1/15LD50三個劑量組與空白組之間在30d試驗期內(nèi)，血液學(xué)組織病理學(xué)均無明顯影響，且無統(tǒng)計學(xué)意義。進而說明，1/50LD50的劑量（0.492mg/kg）對小白鼠無明顯毒性作用。
3．鉤吻的毒性機理研究
3.1鉤吻堿對呼吸、心率、血壓的影響
取鉤吻堿，分別按0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg和8.0mg/kg體重，給家兔作靜脈注射，采用MS302系統(tǒng)相連，記錄其變化。結(jié)果表明，4.0mg/kg能抑制家兔的呼吸運動，后期呼吸不規(guī)則或間歇呼吸。4.0mg/kg的鉤吻堿能使家兔心率減慢，心收縮力下降，導(dǎo)致心輸出量減少，血壓下降。這說明毒素直接作用于心臟和抑制延腦呼吸中樞，引起心率變化和呼吸中樞麻痹。
3.2鉤吻堿對胃腸運動和子宮平滑肌的影響
采用靜脈注射，按0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg體重和直接滴加（按0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%濃度）鉤吻堿的方法，觀察了家兔在體腸運動和兔離體腸、子宮的收縮運動。觀察結(jié)果表明，0.8%濃度的鉤吻堿能輕微抑制家兔的腸蠕動和子宮的收縮，對平滑肌有直接抑制作用，但抑制效果比腎上腺素弱。
4．鉤吻堿對動物的毒性病理學(xué)研究
4.1鉤吻堿對動物的毒性病理
按每公斤干鉤吻粉提取的鉤吻堿0.519mg的量計算，并按0.8%能引起家兔毒性作用的劑量，折合成鉤吻干粉，選擇1%、2%、4%的鉤吻干粉添加在肉仔雞的日糧中，飼喂40d，當飼喂到20d后，2%添加量對肉雞具有明顯促生長作用；當添加量達到4%以上時，肉雞出現(xiàn)體重減輕、流涎、垂頭、嗜睡等毒性臨床癥狀，并表現(xiàn)出全身毛血管擴張，所有內(nèi)臟充血、間質(zhì)性肺氣腫、心力衰竭、腎出血的毒性病理變化。
4.2鉤吻堿對動物的毒性劑量與無毒性劑量的確定
綜上實驗結(jié)果表明，鉤吻總堿按0.5mg/kg體重供給，對動物不產(chǎn)生任何毒副作用；1.0mg/kg體重供給，對動物僅產(chǎn)生呼吸頻率與幅度稍微改變的毒性，且維持時間10min，并無明顯的生理和病理學(xué)改變；4.0mg/kg以上鉤吻堿能引起動物中毒。按提取的鉤吻堿量折算，鉤吻干粉2%添加量在日糧中對肉雞具有促進生長的作用。
5．鉤吻的開發(fā)與利用研究
5.1鉤吻對動物的復(fù)壯增重試驗研究
取一日齡健康仔雞60只，按單因素3處理、2重復(fù)隨機試驗設(shè)計（第1組為對照組，第2、3組為試驗組），各組基本日糧相同，試驗組加1%和2%鉤吻干粉，飼喂40d，每天8時，15時定時飼喂，統(tǒng)計每天飼料消耗量，分別在5日齡、18日齡、30日齡和40日齡各組逐漸稱重，試驗結(jié)束時，經(jīng)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析表明，第2、3組平均未重較第1組（對照組）分別提高5.46%、10.75%，料肉比為：對照組，1:2.79，第2組1:2.66，第3組1:2.57。從而證明2%添加量為優(yōu)。
5.2鉤吻堿對動物的血液學(xué)及免疫功能的影響
5.2.1鉤吻堿對小鼠血液學(xué)的影響
取體重18-25g小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，雌雄各半，第1組為空白組，第2,3,4組為試驗組，每天各灌喂鉤吻堿藥液（10mg/ml）一次，按0.15mg/kg體重，0.30mg/kg和1.5mg/kg分別在灌藥的第5d，第10d，斷尾取血進行RBC數(shù)和Hb量測定。
測定結(jié)果表明，0.15mg/kg組在第5d和10d和0.3mg/kg組均能提高RBC總數(shù)，Hb含量，與對照組比較差異極顯著（P<0.01），而1.5mg/kg組能降低RBC數(shù)和Hb量，與對照組比較，在第10d，降低極明顯（P<0.01）。
5.2.2鉤吻堿對肉雞血液學(xué)的影響
選定80羽健康1日齡三黃雞，經(jīng)飼一周后，隨機分為4組，每組20只，第1組為對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，第2,3,4組為試驗組，按基礎(chǔ)日添加1.5%,2%,6%的鉤吻干粉，飼喂49d。在試驗的7d,21d,35d和49d日齡時，分別頸靜脈采血進行RBC總數(shù)，Hb含量和血液生化指標的檢測。
研究結(jié)果表明，添加鉤吻干粉1.5%劑量、在21日齡時，能顯著提高肉雞RBC數(shù)量、TP含量、Hb量和Alb含量（P<0.01）。在2%添加量時，Hb含量極明顯高于對照組（P<0.05），而RBC數(shù)，ALb含量、TP含量高于對照組（P<0.05），而6%添加時均能降低各種血液值。
肉雞在21d齡時，1.0mg/kg和2mg/kg組，LDH、AKP、SGPT，SGOT酶活性與對照組比較，差異不顯著（P>0.05），而6%組、其LDH、AKP、SGPT、SGOT活性高于對照組，膽堿酯酶（CHE）活性低于對照組，差異不顯著（P<0.05）。 [FS:PAGE]
在49d齡時，1.5mg/kg和2mg/kg組與對照組比較，各種酶的活性差異不顯著，但在6%的試驗組，LDH、ALP極顯著高于對照組（P<0.01），CHE活性顯著低于對照組（P<0.05）。
從而說明，在基礎(chǔ)日糧中添加1.0%、2%鉤吻干粉能顯著提高肉雞的RBC數(shù)，Hb含量，總蛋白含量、白蛋白含量，而6%具有降低的毒性作用。
5.2.3鉤吻堿對動物免疫功能的影響
采用上述試驗的小白鼠和肉雞，在檢測血液學(xué)的同時，對其免疫學(xué)進行了檢測，分別進行了實驗動物的免疫器官（胸腺、脾臟）重量、外周ANAE+淋巴細胞數(shù)量、腹腔巨噬細胞吞噬功能測定，肉雞玫瑰花環(huán)形成率的測定，肉雞ND抗體效價檢測。
檢測結(jié)果表明，鉤吻堿灌胃時對小鼠和肉雞免疫功能的影響存在著劑量差異，0.3mg/kg劑量組能明顯提高免疫功能（P<0.05），而1.5mg/kg以上，則能降低動物的免疫功能（P<0.05）；飼料添加鉤喂干粉，2%或以下量時能提高肉雞某些免疫功能指標，而6%劑量則能降低某些免疫功能指標。
6．鉤吻堿促進動物生長機理研究
6.1鉤吻堿對動物的鎮(zhèn)靜作用
取健康小白鼠預(yù)飼一周后隨機分為5組，進行閾下劑量水合氯醛催眠作用；大白鼠激怒反應(yīng)和小白鼠能量代謝影響的研究。研究結(jié)果表明，按0.5mg/kg體重組，使小白鼠的入睡率比對照組提高了一倍，1.5mg/kg組提高了6倍，而2.5mg/kg組則提高了8倍；由此說明，鉤吻總堿三個劑量組均能協(xié)同閾下劑量的水合氯醛對小白鼠的睡眠作用。鉤吻堿對大白鼠激怒反應(yīng)實驗表明，鉤吻堿對大白鼠由止血鉗所引起的激怒反應(yīng)有很好的抑制作用，表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜的效果。
鉤吻堿對小白鼠的能量代謝影響實驗表明，鉤吻堿能減少機體的能量代謝損失，在非中毒劑量內(nèi)且隨劑量的增加，能量損失越少。
6.2鉤吻堿對動物胃腸道運動的影響
取健康小白鼠40只，體重20±2g，隨機分為4組，每組10只，按生理鹽水10ml/kg體重和0.5mg、1.5mg、2.5mg/kg體重鉤吻堿組，連續(xù)灌胃給藥3d，未次給藥前禁食24h，自由飲水，未次給藥后30min，各鼠均以10%活性碳混懸液20ml/kg灌胃，30min后將小鼠脫頸椎處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取上至幽門、下至回盲部的腸管，計算每只小鼠活性碳的移動距離與小腸全長的百分率。
實驗研究表明，生理鹽水組與鉤吻堿3個不同劑量組對推進率呈現(xiàn)輕微抑制作用（P>0.05），且劑量的增大，其推進率下降，鉤吻堿0.5mg/kg體重組、1.5mg/kg組、2.5mg/kg組較生理鹽水組推進率分別減少0.68%、1.03%、4.03%。
6.3鉤吻堿對消化道內(nèi)菌群數(shù)量的影響，對回腸重量、消化酶活性、內(nèi)容物的PH值的影響
取1d齡健康雛雞60只，按單因素3處理2重復(fù)隨機試驗設(shè)計，第1組為對照組，第2、3組為試驗組（分別添加1%,2%鉤吻干粉），各組基礎(chǔ)日糧相同，籠養(yǎng)，每天在8h與15h定時定量飼喂。試驗的最后1d，喂飼2h后作頸靜脈放血撲殺，打開腹腔，立即取出十二指腸、肌胃、腸道和胃內(nèi)容物，分別測定其PH值，大腸桿菌數(shù)，乳酸桿菌數(shù)，消化酶的活性。
測定結(jié)果表明，回腸中的大腸桿菌，第2組比對照組低6.81%，而第3組含量顯著低于對照組（P<0.05），其值降低10.42%。
回腸中的乳酸桿菌數(shù)，第2、3組與第1組之間差異不明顯（P>0.05），但第2組和第3組較第1組的菌落數(shù)略有增多，其值分別增多2%和3.8%。
回腸鮮重，各組之間差異不明顯（P>0.05）。但肌胃胃蛋白酶活性、十二指腸淀粉酶活性較第1組（對照組）明顯提高，其值分別提高11.6%和26.0%。肌胃內(nèi)容物的PH值，第2組較第1組僅降低0.18個單位，而第3組較第1組降低0.36個單位，差異明顯（P<0.05），而十二指腸內(nèi)容物的pH值；第2和第3組較第1組差異不明顯（P>0.05）。
實驗結(jié)果表明，鉤吻堿能降低回腸中的大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌濃度，增強胃蛋白酶和腸淀粉酶的活性，有利于消化吸收。
7．鉤吻在肌肉和肝臟中的殘留研究
采用薄層層析法，氣相色譜法對日糧中添加2%鉤吻干粉，飼喂30d，60d的肉雞進行肌肉與肝臟鉤吻堿殘留量的檢測。
檢測結(jié)果顯示，在程序升溫條件下，鉤吻素子標準品的保留時間為4.0min，在肌肉和肝中的標準品能檢出，但在日糧中添加了2%鉤吻干粉飼喂30d和60d的肉雞的肌肉與肝臟、檢測結(jié)果為陰性。從而說明鉤吻堿在體內(nèi)幾乎不殘留。
參考文獻：
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9．陳竟峰，袁慧.鉤吻總堿的提取、分離、鑒定及其一般毒性的研究，碩士研究生論文，2002.
10．易金娥,袁慧.鉤吻的毒性機理與毒性病理學(xué)研究.碩士研究生論文，2002.
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