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副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)引起豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，該病又稱為革拉澤氏病(Glasser’SDisease)，影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病。通常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10％～15％，嚴重時死亡率可達到50％。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽，呼吸困難，消瘦，跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現(xiàn)為胸膜炎，心包炎，腹膜炎，關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病。由于飼養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。近年來，隨著養(yǎng)殖水平的提高，副豬嗜血桿菌在我國各豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，其損失相當慘重。
為預(yù)防該病，國內(nèi)外雖然研制了各種類型的基因工程菌苗與多價滅活菌苗，但由于副豬嗜血桿菌血清型眾多，各個地方的流行菌株各不相同，各個血清型之間的交叉保護性不高，菌苗的免疫效果并不理想。筆者對長治市某大型豬場的副豬嗜血桿菌進行了分離和鑒定，以便選擇針對性較強的菌株作為菌苗株，以起到更好的預(yù)防效果，并為副豬嗜血桿菌病的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1．1病料的采集對2個病死仔豬進行尸體解剖(應(yīng)無菌操作)，打開胸腔和腹腔，首先吸取積液或以棉簽拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取內(nèi)臟，內(nèi)臟器官須實驗室無菌操作，以
灼燒過的手術(shù)刀燙烙剖面，取深層組織涂板培養(yǎng)。
1．2主要培養(yǎng)基本試驗選擇以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸鈉0．15g、普通營養(yǎng)瓊脂粉4．5g。加蒸餾水至lOOmL，溶解后調(diào)pH至7．2～7．4，然后高壓上述混合物，120％，15min。在水浴中冷卻至80％。加10mL無
菌脫纖綿羊血，在80％水浴中漩搖10～15min。在冷卻至50％時，加入無菌輔酶I(NAD)至15g／mL，加入萬古霉素至50g／mL。傾倒大約4mm厚平皿，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?/P>
1．3病原分離及純化從分離培養(yǎng)的瓊脂平板上挑取灰白或透明、光滑呈露珠樣的菌落，巧克力瓊脂平板單菌落劃線培養(yǎng)。48h后細菌涂片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性
小桿狀或多形性小桿菌，再進行一次巧克力瓊脂亞克隆培養(yǎng)，同時接種鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板。巧克力瓊脂平板生長良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒有菌落生成則菌株保存待進一步鑒定。經(jīng)初步篩選的分離株CZ株。
1．4染色鏡檢挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特點。
1．5生化特性
1．5．1V因子需要試驗v因子為輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，是細菌呼吸過程中起遞氫作用的兩種脫氫輔酶。挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標準株菌落接種兔鮮血瓊脂平板和2％胨瓊脂平板上，再以金黃色葡萄球菌點種或垂直劃線，置37％培養(yǎng)48h。觀察葡萄球菌菌落周圍菌落生成情況，愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈遠的愈小，甚至不見菌落生長，該現(xiàn)象即稱為“衛(wèi)星現(xiàn)象”。
1．5．2X因子需要試驗x因子是血紅蛋白中的血紅素及其衍生物，含鐵卟啉，121℃高溫下30min不被破壞，是細菌合成細胞色素、細胞色素氧化酶、觸酶和過氧化物酶等的輔
基。挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標準株菌落接種2％胨瓊脂平板上，再分別貼上浸漬有x、V、X+V因子的圓形濾紙片。如果只有含X+V因子的紙片周圍有菌落生長，則表明該
菌株既依賴x因子又依賴V因子。如果只有含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長，則表明該菌株只依賴V因子不依賴X因子。
1．5．3生化實驗脲酶、葡萄糖發(fā)酵、樹膠醛糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、甘露糖發(fā)酵、蜜三糖發(fā)酵、過氧化氫酶實驗等，采用以下培養(yǎng)基基質(zhì)或者商品生化反應(yīng)試劑加入以下特殊培養(yǎng)基成份。配方：BiosatePeptone(BBL)10mg、NaC110mg、酚紅0．04mg、高級瓊脂15mg、蒸餾水900mL。混合加熱溶解，冷后調(diào)節(jié)pH7．5后分裝于密封的瓶子內(nèi)，121℃15min。這方法可用于大量或微量試驗。
2結(jié)果
2．1病原的分離及染色鏡檢CZ株為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)特征。
3討論
3．1在加抗菌素的選擇培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，用特殊的稀釋方法可以提高副豬嗜血桿菌的分離成功率5％CO!或蠟罐培養(yǎng)并不能提高副豬嗜血桿菌的生長速度，用脫纖維蛋白的血和胰蛋白胨血液瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)成分可以提高生長速度；用�；蜓蜓鸵让杆饫业鞍篆傊瑸榕囵B(yǎng)基效果不佳。
3．2疾病發(fā)生時期，畜主多采州抗生素治療，效果往往不理想，其主要原因是副豬嗜血桿菌的耐藥性產(chǎn)生、毒素作用或多種病原混合感染�？股氐氖褂媒o副豬嗜血桿菌的分離造成極大不便，使我們無法確認采集來的標本中是存在副豬嗜血桿菌。
3．3金黃色葡萄球菌等產(chǎn)色素的細菌及酵母茵在生長產(chǎn)過程中可合成v因子，并在培養(yǎng)基中擴散，滿足v子依賴性細菌的生長需求，所以出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。衛(wèi)星現(xiàn)象的產(chǎn)生可以用
來鑒別剮豬嗜血桿菌的v因子依賴性。
3．4嗜血桿菌屬的多數(shù)細菌生長需要供給x子但副豬嗜血桿菌生長不需要x因子。如果只有含V、X+V因子的紙片用有菌落生長，則表明該菌株只依賴V因子不依賴x因子。本實驗中出現(xiàn)v因子依賴性的前提下，x因子依賴陽性的可以否定是副豬嗜血桿菌。
3．5南于副豬嗜血桿菌有較高的培養(yǎng)要求，其生化實驗的關(guān)鍵是特殊培養(yǎng)基基質(zhì)的選擇，或者商品生化反應(yīng)管的營養(yǎng)改良。m清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)成功，但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的PH值等生化特性。
