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近年來(lái)隨著我國(guó)生豬養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖數(shù)量的增加，引進(jìn)的外來(lái)品種越來(lái)越多，市場(chǎng)的流動(dòng)性增大，各養(yǎng)殖豬場(chǎng)在消毒、防疫、治療措施等方面也存在很多空白的地方，造成現(xiàn)在各種豬病的廣泛發(fā)生和傳播，也使得當(dāng)前豬病的特點(diǎn)呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化。當(dāng)前某些疾病的暴發(fā)使得國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還沒(méi)有針對(duì)該疾病的確切免疫保護(hù)效果的商品疫苗供應(yīng)，因此為了挽救不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，有的豬場(chǎng)使用自制自家疫苗免疫。盡管有關(guān)專(zhuān)家呼吁不能長(zhǎng)期或隨意使用自家疫苗，但自制自家疫苗還是經(jīng)常被用來(lái)在特定時(shí)期救急，提醒廣大養(yǎng)殖朋友對(duì)于自家苗一定要正確制作、謹(jǐn)慎使用。
1、材料與方法
1.1.儀器設(shè)備 37℃恒溫培養(yǎng)箱、潔凈組織攪碎機(jī)、解剖刀、電子天平、燒杯、絞肉機(jī)、不銹鋼圓盤(pán)、量筒、玻璃棒、漏斗、滅菌紗布、100毫升滅菌疫苗瓶、干熱高溫滅菌箱、無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、滅菌平皿、EP管架、移液器及其滅菌槍頭、鑷子、接種環(huán)、搖菌床、瓶蓋封口機(jī)、滅菌移液管(10毫升)、250毫升細(xì)胞瓶、酸缸、吸耳球、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、勻漿機(jī)等。
1.2材料試劑 生理鹽水、蒸餾水、甲醛溶液、癥狀典型的病料、TSA、TSB、DMEM(營(yíng)養(yǎng)液含10%小牛血清和氨基葡萄糖、維持液含2%小牛血清)、PK-1.5細(xì)胞、雙抗(青、鏈霉素)、胰蛋白酶等。
1.3自家苗制作
1.3.1自家組織苗制作 選取患有典型癥狀且沒(méi)有用抗生素治療的病豬，用解剖刀宰殺放血，剖開(kāi)胸腹部，選取肺臟、脾臟、淋巴結(jié)(主要是腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié))等器官作為主要病料，如果肝臟和腎臟病變較明顯，也可選取病變明顯部位作為輔助材料，但要盡量保證病料的新鮮，防止其他雜菌污染，以確保組織苗的效果。如果不能及時(shí)處理病料，則需要把病料密封好放在-80℃低溫處保存。將選取的病料放在已滅菌的絞肉機(jī)中絞2～3次，試估計(jì)其重量。取相當(dāng)于病料重量25%～35%的生理鹽水加入病料中混勻，放人組織搗碎機(jī)中搗碎.12000轉(zhuǎn)/分鐘搗碎約2—3分鐘，將搗碎的病料放入不銹鋼圓盤(pán)中密封，最后放人冰箱中冷凍，完全凍結(jié)的病料取出后溶解，如此反復(fù)凍融三遍，再將解凍的病料與生理鹽水按1千克：3500—4000毫升的比例進(jìn)行稀釋調(diào)兌，之后用雙層無(wú)菌醫(yī)用紗布過(guò)濾，然后將過(guò)了兩層紗布的濾液再過(guò)兩次四層紗布，最后所得濾液中加入0.8%的甲醛，一小時(shí)搖勻后，置37℃恒溫箱中滅活，滅活時(shí)間不能太短。滅活期間，每4～6小時(shí)搖動(dòng)一次約半小時(shí)，48小時(shí)后滅活完畢，分裝前按1500國(guó)際單位/毫升比例加入雙抗(青霉素和鏈霉素)，另外還可加入一定量的黃芪多糖并搖勻，以增加豬只抗體的生成，再移至無(wú)菌操作臺(tái)中無(wú)菌分裝于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃ ~8℃下保存待用。
1.3.2自家細(xì)菌苗制作
取本場(chǎng)患有典型癥狀且未用抗生素治療過(guò)的病豬，放血解剖，取豬體肺臟、脾臟、豬腦積液或患有關(guān)節(jié)炎的豬腿關(guān)節(jié)液于無(wú)菌操作臺(tái)上接TSA平板。若無(wú)備用TSA固體平板，先密封病料于-20℃低溫保存，并立即以蒸餾水和TSA粉末按24：1的比例調(diào)配TSA溶液并于114℃下滅菌16分鐘，之后在水浴鍋內(nèi)冷卻至45℃左右時(shí)于無(wú)菌操作臺(tái)上加入5 %的無(wú)支原體小牛血清和0.15%的NAD并搖勻，同時(shí)倒制無(wú)菌TSA平板冷凝待用。接菌的平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱下保持生長(zhǎng)約18小時(shí)左右直至菌落形成，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行細(xì)菌純化、生化鑒定和革蘭氏染色。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前臨床豬細(xì)菌病當(dāng)中主要以副豬嗜血桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌等的原發(fā)或繼發(fā)感染為主。TSA固體平板上鑒定純化的細(xì)菌用TSB液體培養(yǎng)基洗下作菌液并轉(zhuǎn)于500毫升葡萄糖瓶?jī)?nèi)的300毫升TSA液體培養(yǎng)基內(nèi)37℃搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)約18小時(shí)，其中TSB液體培養(yǎng)基以蒸餾水和TSB粉末按33：.1的比例調(diào)配并于114℃滅菌16分鐘，冷卻后再加入1.2‰的NAD。擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)菌再以0.8%甲醛于37℃下?lián)u床搖菌滅活20小時(shí)左右，滅活的細(xì)菌再接TSA平板37℃恒溫培養(yǎng)18小時(shí)左右，根據(jù)平板上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況判斷細(xì)菌甲醛滅活是否徹底。同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌濃縮，以判斷抗原量和提高抗原量，若抗原量過(guò)大，可用滅菌生理鹽水稀釋。當(dāng)驗(yàn)證已滅活徹底且抗原量達(dá)標(biāo)的細(xì)菌方可于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌分裝于100毫升疫苗瓶中，封口后置于4℃~8℃下保存待用。
1.3.3自家病毒苗制作
用于病毒分離的細(xì)胞主要是豬源豬腎細(xì)胞系，如PK-15細(xì)胞，它可用于分離豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬輪狀病毒和豬冠狀病毒等等。經(jīng)酸缸處理并用清水洗凈的細(xì)胞瓶干熱高溫滅菌后置于紫外滅菌的超凈操作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌潔凈移液管往細(xì)胞瓶?jī)?nèi)加入30毫升DMEM營(yíng)養(yǎng)液。同時(shí)用移液管加入5毫升左右的PK-15原代細(xì)胞并吹散混勻，置于37℃恒溫C02培養(yǎng)箱內(nèi)48小時(shí)，其間于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)規(guī)律且無(wú)其他雜菌污染時(shí)便可進(jìn)行下一步的細(xì)胞傳代和放大培養(yǎng)。經(jīng)48小時(shí)后的PK-15細(xì)胞瓶?jī)?nèi)殘液于超凈臺(tái)內(nèi)倒掉，同時(shí)無(wú)菌條件下往瓶?jī)?nèi)加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，使酶溶液浸沒(méi)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞后立即倒掉，然后再無(wú)菌加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，置于37qC恒溫培養(yǎng)箱保持3分鐘左右，取出于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落分散，之后于超凈臺(tái)內(nèi)再倒掉殘液，再加入10毫升左右DMEM營(yíng)養(yǎng)液并用移液管反復(fù)吹打，使得貼壁細(xì)胞充分吹散，然后吸5毫升左右細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞瓶傳代和放大培養(yǎng)。
取經(jīng)PCR或RT-PCR檢測(cè)為病毒感染陽(yáng)性的病料約200毫克置于冷凍管內(nèi)，加入0.1M(摩爾濃度)濃度的PBS緩沖液600微升，勻漿機(jī)以5米/秒勻漿30秒破碎組織病料，然后反復(fù)凍融已破碎的組織病料三遍使得組織內(nèi)感染的病毒釋放，12000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))冷凍離心7分鐘并取上清，上清液用滅菌注射器吸人并注入0.22微米孔徑濾器過(guò)濾，濾液中加入雙抗，并再次以相同孔徑的無(wú)菌濾器過(guò)濾，所得濾液即為本場(chǎng)病料組織中所分得的含有雙抗的病毒液，此病毒液可直接接上細(xì)胞使得病毒生長(zhǎng)繁殖。待接毒的生長(zhǎng)細(xì)胞以正好生長(zhǎng)了36小時(shí)左右的細(xì)胞為宜，接毒之前應(yīng)于超凈臺(tái)內(nèi)倒掉細(xì)胞瓶中的營(yíng)養(yǎng)液，然后無(wú)菌注入含有雙抗的病毒液并在37℃下讓病毒吸附細(xì)胞瓶中的細(xì)胞1小時(shí)，之后再往已接毒的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)無(wú)菌加入DMEM營(yíng)養(yǎng)液約35毫升并于37℃ C02培養(yǎng)箱內(nèi)保持約的病毒液方可于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌分裝于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃—8℃下保存待用。
1.4安全性和有效性的檢查 在投入使用之前，必須對(duì)生產(chǎn)出來(lái)的自家苗進(jìn)行安全性和免疫性效果的檢查。主要是檢測(cè)疫苗是否滅活徹底，是否確實(shí)有效。由于病料中含有的抗原種類(lèi)很多，臨床上只做一些簡(jiǎn)單的動(dòng)物試驗(yàn)。檢測(cè)試驗(yàn)主要包括：①甲醛滅活后的自家苗進(jìn)行小白鼠腹部注射2毫升，觀察24小時(shí);②鏡檢細(xì)菌數(shù)量，并做好記錄。在全場(chǎng)注射之前先用一兩窩豬仔作一下試驗(yàn)，觀察兩天，看有沒(méi)發(fā)生過(guò)敏、或注部位發(fā)生炎。如果沒(méi)有不良反應(yīng)，方可全場(chǎng)鋪開(kāi)注射免疫。
2自家苗的優(yōu)缺點(diǎn)
2、自家苗的優(yōu)點(diǎn)
2 .1.1抗原成分多 組織苗制備時(shí)的病料來(lái)源于發(fā)病動(dòng)物，特別是具有典型癥狀的病料，經(jīng)粉碎滅活后大量制備的自家疫苗，其抗原成分基本包括了本場(chǎng)引起疾病的病原，比較全面的抗原有可能在一定程度上對(duì)接種的動(dòng)物群體進(jìn)行全面的、多方面的誘導(dǎo)，如果滅活到位，有效抗原和位點(diǎn)保留恰當(dāng)，那么在接種后就會(huì)在不同個(gè)體間產(chǎn)生不同程度的免疫反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防和抵抗疾病的目的。吳禮潔等分離豬鏈球菌制備蜂膠佐劑自家滅活苗配合使用敏感藥物，受到了良好的效果。楊彥偉等(2004)將基因工程疫苗與自家苗同時(shí)用于仔豬黃白痢的預(yù)防，結(jié)果表明，自家滅活苗對(duì)仔豬黃白痢的防治效果K88-K99-987P-F41四價(jià)滅活苗效果明顯;呂才火等(2004)制備自家組織滅活苗應(yīng)用于豬藍(lán)耳病和傳染性胸膜肺炎的混合感染：王自振等(2003)制備自家苗對(duì)傳染性胸膜肺炎的防治，效果都很好。
2.1.2具有一定的針對(duì)性 對(duì)于某些病原體，存在很多不同的血清型。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)都有其獨(dú)立的血清群，有時(shí)即使是在同一地區(qū)不同豬場(chǎng)血清型之間的差異也會(huì)很大，甚至在同豬場(chǎng)的同一批豬中也會(huì)存在不同的血清型。不同的血清型之間的抗原交叉保護(hù)力較弱，不可能制備一種覆蓋所有的血清型的超廣譜疫苗。這樣就會(huì)使得某些單一商品疫苗在一定程度上失去了它的免疫保護(hù)效應(yīng)。這在一定程度上使用自家苗也可以說(shuō)是一項(xiàng)救急措施。
12.2自家苗的缺點(diǎn) 專(zhuān)家和政府呼吁絕不可以濫用自家疫苗!從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，濫用自家苗將會(huì)造成某些后患，養(yǎng)豬場(chǎng)的疾病會(huì)越來(lái)越難控制。因此，在使用自家苗之前一定要考慮周全，在考慮到其優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也一定要考慮到使用自家苗的缺點(diǎn)。
2.2.1滅活問(wèn)題和散毒的可能 對(duì)于自家苗滅活的問(wèn)題上存在著很大的風(fēng)險(xiǎn)性，細(xì)菌和病毒的甲醛滅活濃度就不盡相同，需氧菌滅活時(shí)需要的甲醛濃度為0.1%~0.2%，厭氧菌滅活時(shí)需要的甲醛濃度為0.4%—0.5%，而病毒滅活時(shí)需要的甲醛濃度0.05%—0.4%，并且，有些病毒如豬瘟病毒用甲醛滅活的效果不理想，所以在制作不同疫苗的時(shí)候，對(duì)滅活劑的濃度和滅活劑的種類(lèi)要求是不一樣的，滅活劑的種類(lèi)和滅菌濃度選擇的不合理，就無(wú)法達(dá)到滅活的效果。甲醛濃度太低造成自家苗滅活不徹底，濃度過(guò)高，破壞抗原的免疫原性，使得免疫效果變差，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生刺激或發(fā)生損害作用，無(wú)論是過(guò)高還是過(guò)低，同樣都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。制作自家苗是采用具有典型病變的組織為原料，而動(dòng)物死亡之前可能會(huì)繼發(fā)或者混合感染其他的病原體，而這些病原體滅活時(shí)對(duì)甲醛濃度的要求各不相同，如這就造成了滅活不徹底的問(wèn)題。
2.2.2免疫應(yīng)激問(wèn)題 由于組織病料中含有大量組織破碎后形成的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)濾后并不能完全去除這些物質(zhì)，打入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)造成較大應(yīng)激。免疫時(shí)，抗原的劑量必須符合一定的要求，而自家苗中的抗原量無(wú)法準(zhǔn)確確定，抗原量太少，則無(wú)法有效的產(chǎn)生抗體，還有就是：抗原量的含量不符合要求(太多或者太少)都有可能造成免疫耐受。自家苗中含有的抗原種類(lèi)很多，這樣將會(huì)使機(jī)體在一定時(shí)間內(nèi)處于強(qiáng)免疫應(yīng)急狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)其他病原體的抵抗力下降，造成其他疾病的暴發(fā)。
2.2.3免疫效果問(wèn)題 自家苗的質(zhì)量不能得到很好的保證，無(wú)法準(zhǔn)確的測(cè)量出疫苗中抗原的含量。病豬的病變組織中病原的含量存在著很大的變異范圍，即使是同一頭發(fā)18小時(shí)之后收毒測(cè)毒價(jià)，若毒價(jià)很高，便可以此作為種毒進(jìn)行細(xì)胞傳代和放大培養(yǎng)。
當(dāng)病毒培養(yǎng)到一定量時(shí)，便可反復(fù)凍融細(xì)胞三次，使得細(xì)胞內(nèi)病毒釋放，無(wú)菌收集從培養(yǎng)細(xì)胞中所釋放的病毒液置于500毫升無(wú)菌葡萄糖瓶中，以0.5%甲醛滅活約48小時(shí)，之后測(cè)抗原量，并以滅活48小時(shí)之后的病毒液接上細(xì)胞再次培養(yǎng)并做相關(guān)滅活安全性檢測(cè)，當(dāng)驗(yàn)證已滅活徹底且抗原量達(dá)標(biāo)病豬只，由于感染的病原體的類(lèi)型不一致，不同的組織、不同的器官，其病原體的含量也存在著很大的差異。例如：PRRSV在肺部的含量較其他器官多：而CSFV因其具有嗜內(nèi)皮細(xì)胞的特性，因此CSFV在腎臟和免疫器官中的含量較多。正因?yàn)槿绱耍绻巡∝i的所有器官和組織一起搗碎制苗，各種抗原的含量都被稀釋?zhuān)♂尯蟮目乖亢茈y達(dá)到有效免疫的抗原量�；诖朔N原因，用病豬病變組織制作的自家苗，其免疫效果存在著很大的不確定性。一方面無(wú)法確定該疫苗能否對(duì)被免疫的動(dòng)物產(chǎn)生足夠的有效保護(hù)力;另一方面，自家苗使用之后，其典型的病變就會(huì)趨于一致，造成發(fā)病豬缺乏典型病變，不能準(zhǔn)確判斷疾病類(lèi)型，取這樣的組織制備出來(lái)的自家苗的質(zhì)量存在著很大的問(wèn)題，即不同批次的疫苗之間的質(zhì)量存在很大的不確定性。
在使用疫苗的間隔期，可能會(huì)產(chǎn)生抗藥性改變的問(wèn)題，特別是在自家苗的制備過(guò)程中并沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的控制與管理，使得疫苗在質(zhì)量和安全性上存在著很大的危險(xiǎn)性，其使用結(jié)果令人堪憂。特別是對(duì)于某些疾病可以通過(guò)進(jìn)行基因交換恢復(fù)毒力，使得自家苗失去了該有的作用;還有就是，這樣濫用自家苗可能會(huì)造成新型病原體的產(chǎn)生，使其侵入動(dòng)物機(jī)體，導(dǎo)致自家苗完全失去其作用。
2.2.4應(yīng)用范圍問(wèn)題 自家苗是取自己豬場(chǎng)的發(fā)病豬中分離到的病原制成的疫苗，有因地制宜的效果，自家疫苗僅供自己場(chǎng)內(nèi)在遇到特殊疫病時(shí)使用。因此，自家苗的生產(chǎn)、使用區(qū)域以及使用時(shí)限都存在很大的限制性。
3、討論
從歐美畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家對(duì)于疾病的防控歷史情況來(lái)看，他們?cè)谛竽翗I(yè)發(fā)展期間也曾經(jīng)使用過(guò)自家苗的免疫，其中有成功的經(jīng)驗(yàn)也有失敗的教訓(xùn)。由于現(xiàn)在國(guó)內(nèi)動(dòng)物疾病的臨床癥狀越來(lái)越不典型，而某些使用自家苗的豬場(chǎng)免疫效果又很不穩(wěn)定，并且自家組織苗抗原的免疫原性也很不確定，同時(shí)還由于很多自家苗都是在非常簡(jiǎn)陋的情況下制作出來(lái)的，存在很大的危險(xiǎn)。所以，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)很多有遠(yuǎn)見(jiàn)的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)自家苗的態(tài)度發(fā)生了根本的變化，主張并呼吁各單位和各養(yǎng)殖場(chǎng)停止自家苗的研制、開(kāi)發(fā)和臨床使用。這需要政府的強(qiáng)力支持和養(yǎng)豬者思想的轉(zhuǎn)變。
同時(shí)，自家疫苗是針對(duì)自己豬場(chǎng)疾病病原的血清型而分菌或(和)分毒制造成的疫苗，這種針對(duì)本場(chǎng)病原血清型的自家疫苗免疫在一定程度上確實(shí)起到了很好的疾病抗感染效果，這樣在各養(yǎng)豬場(chǎng)自家疫苗的生產(chǎn)又無(wú)法在本豬場(chǎng)被控制和制止。所以對(duì)于自家苗的研制、開(kāi)發(fā)和臨床使用，政府無(wú)論是制止還是正確的引導(dǎo)，這都不是一朝一夕所能完成的事情。
目前，國(guó)內(nèi)動(dòng)物疾病的發(fā)生由以前的單一性疾病向混合型感染發(fā)展，既有細(xì)菌之間的混合感染，又有病毒之間的混合感染，還有細(xì)菌與病毒的混合感染，不管是哪一種混合感染，都有逐步加劇的事態(tài)，鑒于這種情況下，國(guó)內(nèi)自家苗的使用越來(lái)越白熱化。從短期效益來(lái)看，自家苗在一定程度上緩解了豬場(chǎng)疾病的發(fā)展，而從長(zhǎng)遠(yuǎn)設(shè)計(jì)來(lái)看，自家苗的使用不利于養(yǎng)殖業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。
即使要使用自家苗，必須要從自家苗的制作技術(shù)上和臨床使用上進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)控，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。通過(guò)組織各方面的力量來(lái)宣傳自家苗的害處，從長(zhǎng)遠(yuǎn)之計(jì)不利于養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展的勢(shì)態(tài)來(lái)看，必須要改變養(yǎng)殖業(yè)者的思想，并且建議養(yǎng)殖業(yè)者在使用自家苗的同時(shí)，必須進(jìn)行全套的免疫程序?qū)ωi場(chǎng)豬只進(jìn)行免疫，絲毫不能馬虎。給豬只提供全套免疫的同時(shí)，逐步減少自家苗的使用次數(shù)，以達(dá)到完全脫離使用自家苗的目標(biāo)，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展掃平障礙。
