非瘟一周年了，疫苗研發(fā)取得哪些進展？

　非洲豬瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染家豬和野豬引起一種急性、出血性、烈性傳染病，還有可能引起重大的社會經(jīng)濟問題。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，也是我國重點防范的一類動物疫情。ASF已初步呈現(xiàn)出全球流行趨勢，2018年8月進入中國。中國是世界養(yǎng)豬最多的國家，ASF成為了我國養(yǎng)豬業(yè)的重大威脅。
　　
　　非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種大的、復(fù)雜的虹形病毒，該病毒基因組包括一個線性的雙鏈DNA分子，根據(jù)病毒株的不同，其大小約為170~190kb，整個DNA序列兩條鏈包含約151到167個開放閱讀框。由于非洲豬瘟病毒基因型的多樣性，且遺傳信息數(shù)量巨大，具有復(fù)雜多樣的免疫逃逸機制，可以不受宿主免疫細胞的作用，即使疫苗產(chǎn)生一定水平的抗體，仍不具備殺死或者抑制非洲豬瘟病毒的能力。使得科學家不得不多角度開展疫苗的研制工作，包括滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗和弱毒疫苗等。
　　
　　本文概述了各種疫苗的最新研究進展：
　　
　　一、滅活疫苗
　　
　　ASF滅活疫苗是最先開始嘗試研究的，包括病毒接種肺泡巨噬細胞以及感染脾組織后勻漿，經(jīng)加熱、復(fù)方碘溶液、甲苯、福爾馬林、結(jié)晶紫、β-丙內(nèi)酯、乙酰氮丙啶和縮水甘油醛等物理、化學處理的ASFV滅活疫苗，雖部分能刺激豬產(chǎn)生抗體，仍無法抵御ASFV的攻擊。Blome 等于2014年利用最新的佐劑PolygenTM/Emulsigen®-D和制備技術(shù)對ASF滅活疫苗進行了重新評估，免疫的豬只模擬自然感染采用了較高的攻毒劑量（109 TCID50/mL），用強毒攻擊后可產(chǎn)生ASFV特異性抗體，但很快出現(xiàn)了急性臨床癥狀，表現(xiàn)為發(fā)病，幾乎無效。鑒于現(xiàn)有研究結(jié)果，采用傳統(tǒng)方法研制有效的ASF滅活疫苗困難很大。
　　
　　二、亞單位疫苗
　　
　　ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通過合適抗原傳遞系統(tǒng)免疫動物。選擇具有保護作用的抗原基因 (p72、p54、p30、CD2v)，利用桿狀病毒系統(tǒng)進行表達。使用p54和p30共同免疫豬只，可以提供部分的保護作用。然而當使用p72、p54、p30共同免疫時卻不能提供保護作用。利用桿狀病毒表達的CD2v可以誘導(dǎo)針對ASFV強毒株的部分保護。說明僅僅依靠上述抗原刺激產(chǎn)生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護效果。在另一組研究中，Lopera-Madrid等分別以人源293（HEK）細胞表達的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亞單位抗原，或者痘苗病毒載體疫苗進行首免和加強免疫，獲得較好的體液免疫和細胞免疫水平。因此，還需要研究鑒定更多的ASFV保護性抗原、開發(fā)新型免疫佐劑，以及采用DNA首免蛋白質(zhì)加強免疫策略，以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。
　　
　　三、核酸疫苗（DNA疫苗）
　　
　　通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達載體后，直接導(dǎo)入機體內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白，從而同時激活體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。最新研究表明，根據(jù)一個或兩個ASFV抗原構(gòu)建的DNA疫苗并不能誘導(dǎo)較高免疫保護，而免疫ASFV基因組DNA質(zhì)粒表達文庫能夠提供60%的保護力，說明有待于發(fā)掘更多保護性抗原，以提高核酸疫苗的保護水平
　　
　　四、病毒活載體疫苗
　　
　　目前集中在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面，通過選用痘病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒等載體，表達ASFV保護性抗原基因(p72、p54、p30、CD2v、p12、EP153R)，使用“雞尾酒”式混合免疫或者加強免疫策略，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫豬只可以產(chǎn)生特異性抗體和CTL（細胞毒性T淋巴細胞）反應(yīng)。2016年美國德克薩斯A&M大學（舊譯為“德州農(nóng)工大學”）獸醫(yī)病理學系研究人員，將非洲豬瘟病毒抗原基因重組入復(fù)制缺陷型腺病毒載體，通過混合免疫后能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和細胞免疫應(yīng)答，但仍需通過攻毒保護試驗，進一步驗證其可行性。
　　
　　五、減毒活疫苗
　　
　　目前有三種減毒形式：傳代致弱毒株、天然致弱毒株、人工基因缺失致弱毒株。
　　
　　1、傳代致弱毒株
　　
　　ASFV可經(jīng)過豬骨髓來源細胞、Vero和COS-1等細胞系傳代致弱。傳代過程中，ASFV致病力逐漸下降，同時病毒免疫原性和穩(wěn)定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙，使用傳代致弱毒株免疫動物后產(chǎn)生了災(zāi)難性的后果，免疫動物呈現(xiàn)出肺炎、流產(chǎn)和死亡等副作用，在田間多次感染和異源強毒株存在的條件下，許多免疫動物呈現(xiàn)ASF慢性感染臨床癥狀。因此，傳代致弱毒株的致病性導(dǎo)致此類疫苗的開發(fā)一度受阻。Krug等利用分離株ASFV-G在Vero細胞中進行傳代培養(yǎng)，隨著傳代次數(shù)的增加，ASFV-G在Vero細胞中的復(fù)制能力增強，同時在豬原代巨噬細胞中的復(fù)制能力下降，病毒毒力逐漸衰減，在傳至第110代時完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株后并未獲得相應(yīng)保護力，不能抵抗母本病毒的攻擊，表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護。
　　
　　2、天然致弱毒株
　　
　　從軟蜱及慢性感染豬只體內(nèi)分離到了一些天然弱毒株OURT88/3或NH/P68免疫動物后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生對同源強毒株的攻毒保護，由于免疫途徑、免疫劑量、攻毒株的不同，保護率介于66%~100%。研究表明，病毒特異性抗體以及CD8+T細胞在免疫保護中均起重要作用，且OURT88/3毒株產(chǎn)生的免疫保護與病毒特異性IFN-γ產(chǎn)生細胞呈正相關(guān)性。采用NH/P68免疫后，豬對高毒力ASFV/L60感染抵抗力增強。以O(shè)URT88/3免疫并用致病性O(shè)URT88/1毒株進行加強免疫后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對ASFV I型不同分離毒株的交叉保護，表明研制具有交叉保護的ASFV疫苗是可能的。然而，天然致弱毒株免疫動物后可造成諸多副反應(yīng)，包括肺炎、流產(chǎn)、死亡等，免疫NH/P68毒株后25%~47%的豬呈現(xiàn)慢性感染；免疫OURT88/3后可導(dǎo)致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。總之，天然致弱毒株導(dǎo)致的諸多副反應(yīng)，以及存在散毒的可能性等生物安全隱患，限制了其在實際生產(chǎn)中的進一步應(yīng)用。
　　
　　3、基因缺失疫苗
　　
　　采用分子生物學方法，敲除ASFV強毒株或者弱毒株的病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應(yīng)答，研制比傳統(tǒng)弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。一些ASFV毒株在缺失單個或多個毒力基因或免疫抑制基因后，如TK（K196R）、9GL（B119L）、CD2v（EP402R）、DP148R、NL（DP71L）、UK（DP96R）和多基因家族360和505（MGF 360/505），缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護，大部分基因缺失疫苗的保護率可高達100%，免疫后可以抵抗親本毒株的攻擊，具有同源保護作用；有的可以抵抗異源毒株的攻擊，即具有異源保護作用，但也有一些候選株保護效力下降，甚至無保護作用。BA71毒株缺失CD2v基因后對基因Ⅰ型和Ⅱ型ASFV均能提供完全保護，具有交叉保護作用，未來開發(fā)前景較大�；�因缺失疫苗可以提供完全保護，但卻存在殘余毒力，免疫后可引起亞臨床癥狀和病毒血癥等問題，阻礙了其商業(yè)化進程，是需要著力解決的問題。
　　
　　目前的ASF疫苗都不盡人意，滅活苗幾乎無效；而亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗的保護效力偏低，需要對ASFV的免疫應(yīng)答機制進行深入研究。瓶頸是不清楚可誘導(dǎo)完全保護的病毒抗原（蛋白），鑒定保護性抗原基因，解析ASFV免疫保護的分子機制，同時需要研發(fā)高效的抗原遞送系統(tǒng)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的ASFV特異性抗體，提高疫苗的保護率。ASF疫苗研究主要集中在減毒活疫苗和基因缺失疫苗，非洲豬瘟基因缺失疫苗可以提供完全保護，是短期內(nèi)最有希望的疫苗，其安全性可以通過進一步缺失毒力或免疫抑制相關(guān)基因來解決。
　　
　　目前全球至少8個國家15個研究機構(gòu)正致力于非洲豬瘟疫苗研發(fā)，2017年底，歐盟發(fā)起了針對非洲豬瘟疫苗的創(chuàng)新行動。2018年3月底，西班牙的科學家在Vaccine雜志上發(fā)表研究他們以毒株NH/P68為骨架，研制了缺失某些特定基因的弱毒活疫苗，能夠有效防控非洲豬瘟病毒感染，下一步將研究如何提高該弱毒疫苗的安全性和有效性。2018年10月15日，美國農(nóng)業(yè)研究局將授予Zoetis（碩騰）有限責任公司獨家使用“基于MGF基因缺失的減毒非洲豬瘟疫苗”的專利。2019年3月22日，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家非洲豬瘟專業(yè)實驗室發(fā)表的最新成果，研究人員利用2018年9月3日黑龍江省佳木斯疫情發(fā)病豬樣品，接種豬原代肺泡巨噬細胞，成功分離出Pig/HLJ/18。進行了較為系統(tǒng)的研究，繼而開展病原學關(guān)于感染性、致病力和傳播能力等生物學特性研究和動物病例研究，并建立了動物感染模型，去年12月初實驗已經(jīng)完成。
　　
　　但是要進行疫苗商品化還需進行：種毒毒力基因鑒定模型，找到ASF疫苗生產(chǎn)細胞系，確定在細胞或豬體內(nèi)遺傳穩(wěn)定，區(qū)別野毒感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法，在ABSL3以上實驗室進行疫苗評價相關(guān)試驗等工作。鑒于以上原因，非洲豬瘟在短期內(nèi)仍然不會有商品化疫苗出現(xiàn)，因此生物安全仍然是控制該病的最優(yōu)措施。

如您養(yǎng)豬遇到問題，點擊給我們留言！