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非瘟一周年了,疫苗研發(fā)取得哪些進展?

2019-08-06 08:30:19來源:網(wǎng)絡(luò)作者:瀏覽:次 分享:
 非洲豬瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)感染家豬和野豬引起一種急性、出血性、烈性傳染病,還有可能引起重大的社會經(jīng)濟問題。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病,也是我國重點防范的一類動物疫情。ASF已初步呈現(xiàn)出全球流行趨勢,2018年8月進入中國。中國是世界養(yǎng)豬最多的國家,ASF成為了我國養(yǎng)豬業(yè)的重大威脅。
  
  非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種大的、復(fù)雜的虹形病毒,該病毒基因組包括一個線性的雙鏈DNA分子,根據(jù)病毒株的不同,其大小約為170~190kb,整個DNA序列兩條鏈包含約151到167個開放閱讀框。由于非洲豬瘟病毒基因型的多樣性,且遺傳信息數(shù)量巨大,具有復(fù)雜多樣的免疫逃逸機制,可以不受宿主免疫細胞的作用,即使疫苗產(chǎn)生一定水平的抗體,仍不具備殺死或者抑制非洲豬瘟病毒的能力。使得科學家不得不多角度開展疫苗的研制工作,包括滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗和弱毒疫苗等。
  
  本文概述了各種疫苗的最新研究進展:
  
  一、滅活疫苗
  
  ASF滅活疫苗是最先開始嘗試研究的,包括病毒接種肺泡巨噬細胞以及感染脾組織后勻漿,經(jīng)加熱、復(fù)方碘溶液、甲苯、福爾馬林、結(jié)晶紫、β-丙內(nèi)酯、乙酰氮丙啶和縮水甘油醛等物理、化學處理的ASFV滅活疫苗,雖部分能刺激豬產(chǎn)生抗體,仍無法抵御ASFV的攻擊。Blome 等于2014年利用最新的佐劑PolygenTM/Emulsigen®-D和制備技術(shù)對ASF滅活疫苗進行了重新評估,免疫的豬只模擬自然感染采用了較高的攻毒劑量(109 TCID50/mL),用強毒攻擊后可產(chǎn)生ASFV特異性抗體,但很快出現(xiàn)了急性臨床癥狀,表現(xiàn)為發(fā)病,幾乎無效。鑒于現(xiàn)有研究結(jié)果,采用傳統(tǒng)方法研制有效的ASF滅活疫苗困難很大。
  
  二、亞單位疫苗
  
  ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原,需通過合適抗原傳遞系統(tǒng)免疫動物。選擇具有保護作用的抗原基因 (p72、p54、p30、CD2v),利用桿狀病毒系統(tǒng)進行表達。使用p54和p30共同免疫豬只,可以提供部分的保護作用。然而當使用p72、p54、p30共同免疫時卻不能提供保護作用。利用桿狀病毒表達的CD2v可以誘導(dǎo)針對ASFV強毒株的部分保護。說明僅僅依靠上述抗原刺激產(chǎn)生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護效果。在另一組研究中,Lopera-Madrid等分別以人源293(HEK)細胞表達的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亞單位抗原,或者痘苗病毒載體疫苗進行首免和加強免疫,獲得較好的體液免疫和細胞免疫水平。因此,還需要研究鑒定更多的ASFV保護性抗原、開發(fā)新型免疫佐劑,以及采用DNA首免蛋白質(zhì)加強免疫策略,以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。
  
  三、核酸疫苗(DNA疫苗)
  
  通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達載體后,直接導(dǎo)入機體內(nèi),在宿主細胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白,從而同時激活體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。最新研究表明,根據(jù)一個或兩個ASFV抗原構(gòu)建的DNA疫苗并不能誘導(dǎo)較高免疫保護,而免疫ASFV基因組DNA質(zhì)粒表達文庫能夠提供60%的保護力,說明有待于發(fā)掘更多保護性抗原,以提高核酸疫苗的保護水平
  
  四、病毒活載體疫苗
  
  目前集中在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面,通過選用痘病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒等載體,表達ASFV保護性抗原基因(p72、p54、p30、CD2v、p12、EP153R),使用“雞尾酒”式混合免疫或者加強免疫策略,結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫豬只可以產(chǎn)生特異性抗體和CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應(yīng)。2016年美國德克薩斯A&M大學(舊譯為“德州農(nóng)工大學”)獸醫(yī)病理學系研究人員,將非洲豬瘟病毒抗原基因重組入復(fù)制缺陷型腺病毒載體,通過混合免疫后能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和細胞免疫應(yīng)答,但仍需通過攻毒保護試驗,進一步驗證其可行性。
  
  五、減毒活疫苗
  
  目前有三種減毒形式:傳代致弱毒株、天然致弱毒株、人工基因缺失致弱毒株。
  
  1、傳代致弱毒株
  
  ASFV可經(jīng)過豬骨髓來源細胞、Vero和COS-1等細胞系傳代致弱。傳代過程中,ASFV致病力逐漸下降,同時病毒免疫原性和穩(wěn)定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙,使用傳代致弱毒株免疫動物后產(chǎn)生了災(zāi)難性的后果,免疫動物呈現(xiàn)出肺炎、流產(chǎn)和死亡等副作用,在田間多次感染和異源強毒株存在的條件下,許多免疫動物呈現(xiàn)ASF慢性感染臨床癥狀。因此,傳代致弱毒株的致病性導(dǎo)致此類疫苗的開發(fā)一度受阻。Krug等利用分離株ASFV-G在Vero細胞中進行傳代培養(yǎng),隨著傳代次數(shù)的增加,ASFV-G在Vero細胞中的復(fù)制能力增強,同時在豬原代巨噬細胞中的復(fù)制能力下降,病毒毒力逐漸衰減,在傳至第110代時完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株后并未獲得相應(yīng)保護力,不能抵抗母本病毒的攻擊,表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護。
  
  2、天然致弱毒株
  
  從軟蜱及慢性感染豬只體內(nèi)分離到了一些天然弱毒株OURT88/3或NH/P68免疫動物后,能誘導(dǎo)產(chǎn)生對同源強毒株的攻毒保護,由于免疫途徑、免疫劑量、攻毒株的不同,保護率介于66%~100%。研究表明,病毒特異性抗體以及CD8+T細胞在免疫保護中均起重要作用,且OURT88/3毒株產(chǎn)生的免疫保護與病毒特異性IFN-γ產(chǎn)生細胞呈正相關(guān)性。采用NH/P68免疫后,豬對高毒力ASFV/L60感染抵抗力增強。以O(shè)URT88/3免疫并用致病性O(shè)URT88/1毒株進行加強免疫后,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對ASFV I型不同分離毒株的交叉保護,表明研制具有交叉保護的ASFV疫苗是可能的。然而,天然致弱毒株免疫動物后可造成諸多副反應(yīng),包括肺炎、流產(chǎn)、死亡等,免疫NH/P68毒株后25%~47%的豬呈現(xiàn)慢性感染;免疫OURT88/3后可導(dǎo)致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。總之,天然致弱毒株導(dǎo)致的諸多副反應(yīng),以及存在散毒的可能性等生物安全隱患,限制了其在實際生產(chǎn)中的進一步應(yīng)用。
  
  3、基因缺失疫苗
  
  采用分子生物學方法,敲除ASFV強毒株或者弱毒株的病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因,可降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應(yīng)答,研制比傳統(tǒng)弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。一些ASFV毒株在缺失單個或多個毒力基因或免疫抑制基因后,如TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2v(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF 360/505),缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護,大部分基因缺失疫苗的保護率可高達100%,免疫后可以抵抗親本毒株的攻擊,具有同源保護作用;有的可以抵抗異源毒株的攻擊,即具有異源保護作用,但也有一些候選株保護效力下降,甚至無保護作用。BA71毒株缺失CD2v基因后對基因Ⅰ型和Ⅱ型ASFV均能提供完全保護,具有交叉保護作用,未來開發(fā)前景較大;蛉笔б呙缈梢蕴峁┩耆Wo,但卻存在殘余毒力,免疫后可引起亞臨床癥狀和病毒血癥等問題,阻礙了其商業(yè)化進程,是需要著力解決的問題。
  
  目前的ASF疫苗都不盡人意,滅活苗幾乎無效;而亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗的保護效力偏低,需要對ASFV的免疫應(yīng)答機制進行深入研究。瓶頸是不清楚可誘導(dǎo)完全保護的病毒抗原(蛋白),鑒定保護性抗原基因,解析ASFV免疫保護的分子機制,同時需要研發(fā)高效的抗原遞送系統(tǒng),以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的ASFV特異性抗體,提高疫苗的保護率。ASF疫苗研究主要集中在減毒活疫苗和基因缺失疫苗,非洲豬瘟基因缺失疫苗可以提供完全保護,是短期內(nèi)最有希望的疫苗,其安全性可以通過進一步缺失毒力或免疫抑制相關(guān)基因來解決。
  
  目前全球至少8個國家15個研究機構(gòu)正致力于非洲豬瘟疫苗研發(fā),2017年底,歐盟發(fā)起了針對非洲豬瘟疫苗的創(chuàng)新行動。2018年3月底,西班牙的科學家在Vaccine雜志上發(fā)表研究他們以毒株NH/P68為骨架,研制了缺失某些特定基因的弱毒活疫苗,能夠有效防控非洲豬瘟病毒感染,下一步將研究如何提高該弱毒疫苗的安全性和有效性。2018年10月15日,美國農(nóng)業(yè)研究局將授予Zoetis(碩騰)有限責任公司獨家使用“基于MGF基因缺失的減毒非洲豬瘟疫苗”的專利。2019年3月22日,中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家非洲豬瘟專業(yè)實驗室發(fā)表的最新成果,研究人員利用2018年9月3日黑龍江省佳木斯疫情發(fā)病豬樣品,接種豬原代肺泡巨噬細胞,成功分離出Pig/HLJ/18。進行了較為系統(tǒng)的研究,繼而開展病原學關(guān)于感染性、致病力和傳播能力等生物學特性研究和動物病例研究,并建立了動物感染模型,去年12月初實驗已經(jīng)完成。
  
  但是要進行疫苗商品化還需進行:種毒毒力基因鑒定模型,找到ASF疫苗生產(chǎn)細胞系,確定在細胞或豬體內(nèi)遺傳穩(wěn)定,區(qū)別野毒感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法,在ABSL3以上實驗室進行疫苗評價相關(guān)試驗等工作。鑒于以上原因,非洲豬瘟在短期內(nèi)仍然不會有商品化疫苗出現(xiàn),因此生物安全仍然是控制該病的最優(yōu)措施。

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