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偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的包括多種家畜和野生動物發(fā)病的一種烈性傳染病。偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科。感染性的病毒由四個不同的結(jié)構(gòu)組成，分別是(圖1)。中央核芯由線狀雙鏈 DNA 組成，DNA 同附于其上的具有保護性的二十面體形狀的衣殼共同構(gòu)成核衣殼，由蛋白質(zhì)構(gòu)成間質(zhì)嵌入衣殼中，最外層被由多種病毒糖蛋白組成的囊膜包裹。
圖1 偽狂犬病毒結(jié)構(gòu)
1、了解偽狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)及獨立相關(guān)蛋白的功能
偽狂犬病毒基因組為雙股DNA，大小為150kb，由長獨特區(qū)(UL)和短獨特區(qū)(US)以及US兩側(cè)的末端重復序列(TR)與內(nèi)部重復序列(IR)所組成。目前已經(jīng)知道成熟病毒粒子有50種蛋白質(zhì)，已命名的有11種糖蛋白，其中與毒力有關(guān)的糖蛋白有g(shù)C、gD、gE、gl。此外，胸苷激酶(TK)、核苷酸還原酶(RR)、蛋白激酶(，PK)、堿性核酸外切酶(AN)和脫氧尿苷三磷3酸激酶(dUTPase)等幾種酶也與病毒的毒力密切相關(guān)。毒力是決定病毒是否能引起動物發(fā)病、死亡的關(guān)鍵性因素，偽狂犬的毒力由多個基因決定，了解這些基因有助于我們研制出新型偽狂犬疫苗，消除偽狂犬病的危害。這些基因主要功能如下(表1)。
表1 與偽狂犬病病毒毒力相關(guān)的蛋白
2、TK基因的缺失到底有沒有現(xiàn)實意義?
如表1所示，TK基因是與毒力相關(guān)的主要基因之一，它與病毒的復制、潛伏感染有關(guān)。有研究表明TK基因的缺失可使其對豬和反芻動物的毒力顯著降低，同時潛伏感染能力也下降。因此TK基因的缺失苗成為人們研究的焦點，Kit于1948年利用BUK株確實TK基因內(nèi)部148bp制成疫苗，該疫苗沒有出現(xiàn)毒力回復現(xiàn)象，對豬提供了有效保護。在國內(nèi)，四川農(nóng)業(yè)大學構(gòu)建出Fa株TK基因缺失苗，接種小豬也顯示了很好的免疫效果。鑒于這些早期的研究成果，很多疫苗廠家都以TK基因缺失為基礎研發(fā)新型疫苗，當前TK基因的缺失真的有現(xiàn)實意義嗎?
雖然TK基因的缺失降低了病毒的毒力，科研院所及疫苗廠家以TK基因缺失研發(fā)的新型疫苗也顯示出一定效果，但TK基因的缺失存在一定病毒基因重組的風險，其免疫原性也會受到影響。最近有研究表明，某些弱毒疫苗會移植至免疫豬的隱性靶組織即三叉神經(jīng)元，并通過與偽狂犬野毒的超感染競爭，從而阻斷隱性感染的發(fā)生。研究還表明，缺失TK基因的弱毒苗在三叉神經(jīng)節(jié)的移植能力幾乎沒有。而阻斷和減少野毒潛伏性感染在偽狂犬病的防制中是至關(guān)重要的。
研究表明：單獨通過基因工程手段來缺失TK基因，其病毒的毒力還是存在一部分，對豬仍有一定的風險。而目前市面上安全有效的弱毒疫苗都是通過反復傳代培養(yǎng)獲得，通過若干代的培養(yǎng)后病毒的毒力基因發(fā)生一些突變，大幅度降低了病毒的毒力，實踐證明這樣的自然傳代方式才是安全有效的。僅僅通過基因工程手段敲掉TK基因，在臨床應用上還是會存在一定風險。
目前研發(fā)偽狂犬基因缺失苗主要目的是鑒別免疫豬和野毒感染豬，為凈化豬場偽狂犬病提供一種監(jiān)測手段。雖然接種TK基因缺失苗，豬能產(chǎn)生很強的抵抗偽狂犬強毒的攻擊，但是因TK基因?qū)儆诿傅鞍谆颍隗w內(nèi)不能產(chǎn)生相應的抗體，因此不能用血清學方法區(qū)別免疫接種豬與自然感染豬。
通過上述論證，可以看出以TK基因缺失來作為研發(fā)偽狂犬基因缺失苗基礎沒有現(xiàn)實意義。
3、gE基因的缺失將更具有現(xiàn)實意義。
如圖1所示，gE基因也是偽狂犬病毒一個重要的毒力基因，在偽狂犬病毒向神經(jīng)系統(tǒng)的擴散中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，只要缺失掉gE 5’端第125位的纈氨酸和第126位的半胱氨酸，偽狂犬病毒毒力就會大大降低且不影響其免疫原性。gE糖蛋白的N端33位到100位的氨基酸區(qū)段包含了主要抗原表位，缺失掉該段基因，在機體內(nèi)就不能產(chǎn)生相應的杭體，這為區(qū)別野毒感染和疫苗接種提供了依據(jù)。
近幾年gE基因缺失已經(jīng)成為國內(nèi)外研究焦點，Quint等對偽狂犬NIA-3株進行g(shù)E基因缺失，構(gòu)建的偽狂犬突變株能明顯降低對小鼠和10周齡仔豬的毒力，免疫豬能抵抗強毒的致死攻擊。國內(nèi)，四川農(nóng)業(yè)大學也成功構(gòu)建出gE/gI基因缺失株，顯示出良好的免疫效果。國內(nèi)外的大型動物疫苗公司也投入大量的人力、物力研發(fā)以gE基因缺失為基礎的新型疫苗。
在豬場的常規(guī)免疫過程中，普通疫苗在接種后雖然能預防臨床癥狀的出現(xiàn)，但不能防止強毒在被感染動物體內(nèi)復制、排出。此時利用gE基因缺失疫苗免疫并結(jié)合gE-ELISA檢測抗gE抗體來區(qū)分開接種血清陽性豬和野毒感染血清陽性豬。這種接種gE基因缺失疫苗結(jié)合鑒別性診斷能力現(xiàn)在已成為在世界各國及地區(qū)推廣的偽狂犬病消除計劃的理論基礎。所以說研發(fā)以偽狂犬gE基因缺失為基礎的疫苗更具有現(xiàn)實意義。
4、小結(jié)
綜上所述，從阻斷和減少野毒潛伏性感染、毒力減弱及野毒鑒別三個方面看，TK基因缺失來作為研發(fā)偽狂犬基因缺失苗基礎沒有現(xiàn)實意義。偽狂犬病的凈化之路任重而道遠，具有鑒別野毒能力的偽狂犬基因缺失苗的出現(xiàn)讓我們看到了希望，然而TK基因缺失苗對于偽狂犬的凈化起不到任何作用，在阻斷和減少野毒潛伏性感染方面幾乎沒有作用，臨床應用也存在一定風險，與gE基因缺失相比TK綜上所述，從阻斷和減少野毒潛伏性感染、毒力減弱及野毒鑒別三個方面看，TK基因缺失來作為研發(fā)偽狂犬基因缺失苗基礎沒有現(xiàn)實意義。偽狂犬病的凈化之路任重而道遠，具有鑒別野毒能力的偽狂犬基因缺失苗的出現(xiàn)讓我們看到了希望，然而TK基因缺失苗對于偽狂犬的凈化起不到任何作用，在阻斷和減少野毒潛伏性感染方面幾乎沒有作用，臨床應用也存在一定風險，與gE基因缺失相比TK基因缺失沒有現(xiàn)實意義。
目前豬場免疫偽狂犬疫苗較多使用基因缺失苗，但是基因缺失苗也有較多的分類，有單基因缺失的，也有多基因缺失的，豬場到底該使用哪種疫苗，這是目前爭論較多的問題，怎樣認識這個問題，我覺得可從以下幾方面來分析：
1、多基因缺失苗不等于多價苗
這是普通常識，多價苗是含有多種抗原成份，免疫后對豬提供更多的保護。多基因缺失苗則是缺失多個基因，減少了一些抗原成份。當然減少的這些抗原成份對總體的免疫效果影響不大。
2、基因缺失的目的
基因缺失的主要目的是為了鑒別免疫豬和野毒感染豬，為根除偽狂犬病提供血清學監(jiān)測依據(jù)。目前，世界通用的是gE單克隆抗體ELISA試劑盒，單基因缺失苗和多基因缺失苗都能通過此試劑盒達到鑒別目的，從這一意義上來說，二者沒有任何區(qū)別。
3、免疫效力
到目前為止，還沒有權(quán)威性的論著對單基因缺失苗和多基因缺失苗免疫效力之間的優(yōu)劣做過評述，從所了解的各豬場實際應用看，二者對控制偽狂犬病均具有良好的效果。抗體水平的監(jiān)測也沒有發(fā)現(xiàn)二者之間存在差異。最近的研究表明，某些弱毒疫苗會移植至免疫豬的隱性靶組織即三叉神經(jīng)元，并通過與偽狂犬野毒的超感染競爭，從而阻斷隱性感染的發(fā)生。研究還表明，既缺失糖蛋白gE又缺失Tk基因的弱毒苗在三叉神經(jīng)節(jié)的移植能力弱。而阻斷和減少野毒潛伏性感染在偽狂犬病的防制中是至關(guān)重要的。
4、安全性
這是雙方爭論的焦點問題，主要是關(guān)于單基因缺失苗是否安全的爭論。
基因缺失在減毒方面有一定作用，但顯然非常有限，從免疫學角度來看，疫苗的減毒主要還是依賴于繼代培養(yǎng)。目前除偽狂犬病疫苗外，其它疫苗都沒有缺失基因，其中家禽用疫苗有十多種，豬用疫苗有五、六種，人用疫苗有七、八種，如果說這些疫苗存在毒力返強或其它安全性問題，顯然與事實不符。因此，不能因為某一種疫苗缺失基因，就過分夸大基因缺失在安全性方面的作用，甚至把基因缺失的多少作為衡量一個疫苗安全性的依據(jù)。
從歷史的角度看，單基因缺失疫苗(如Bartha株)是一個使用歷史最長(1961年研制成功)、范圍最廣、數(shù)量最多的弱毒疫苗。世界上五十多年的應用實踐已經(jīng)表明這是一個免疫力和安全性都很好的疫苗株。因此，不能因為多基因缺失苗(如同時缺失TK基因)強調(diào)其安全性就反過來懷疑單基因缺失苗的安全性，這與思維邏輯不符，更與發(fā)生的事實不符。
從現(xiàn)實的角度看，單基因缺失苗仍然是世界范圍內(nèi)用來防制偽狂犬病的主要品種，在十分注重生物安全的歐美國家，生產(chǎn)和使用一種不安全的疫苗是令人難以想象的。
到目前為止，已有幾家外國公司的Bartha株單基因缺失弱毒苗獲得了我國農(nóng)業(yè)部的批準注冊，并被允許進口。我國也是一個越來越注重生物安全的國家，批準注冊這些單基因缺失苗時，是從各個方面充分考慮、認證了其安全性因素，顯然有關(guān)單基因缺失弱毒疫苗存在安全問題的說法是完全不可信的。
南方某某省幾十個規(guī)�；i場從1999年就開始使用單基因缺失弱毒苗，至今未發(fā)生安全性問題。不可否認，曾有個別豬場在使用單基因缺失弱毒苗后，出現(xiàn)一些問題，但經(jīng)實驗室檢測，問題不在疫苗，而是該豬場在接種疫苗時已經(jīng)感染了其它繁殖障礙性疾病，豬場人員也表示，接種疫苗就已經(jīng)有問題發(fā)生。這種偶然情況在其它類型的疫苗使用過程中也會碰到。
