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背 景
1）低蛋白日糧的精髓在于降低蛋白保持氨基酸高水平不降低。
2）降蛋白的同時(shí)讓我們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注更多種氨基酸的平衡。
3）隨著氨基酸工業(yè)化的發(fā)展，晶體氨基酸的添加成本在降低，能夠在飼料中添加的氨基酸品種越來越來越多。
4）支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）功效一再被證實(shí)，正在被廣泛應(yīng)用。
目 的
研究低蛋白日糧添加BCAA對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、采食量及肌肉重量的影響。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇33日齡斷奶、體重（8.45±0.62kg）相近的長(zhǎng)Х大二元雜交閹割公豬28頭，代謝籠單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為四組，分別為正對(duì)照組PC（高蛋白日糧組),負(fù)對(duì)照組NC（降蛋白不補(bǔ)充Leu、Ile、Val ),實(shí)驗(yàn)1組T1（補(bǔ)充Leu、Ile、Val達(dá)到正對(duì)照組水平），實(shí)驗(yàn)2組T2（添加Leu、Ile、Val的量是實(shí)驗(yàn)1組的2倍）
表1 試驗(yàn)日糧的組成（%）
表2 試驗(yàn)日糧的營(yíng)養(yǎng)成分
結(jié) 果
與負(fù)對(duì)照相比，添加BCAAs的T1組T2組顯著提高了日增重，日均采食量、肉料比(P＜0.05）。且與正對(duì)照組相比在日增重、日均采食量、肉料比均無差異。如圖1
圖1：低蛋白日糧添加BCAAs對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響
與正對(duì)照組相比，低蛋白日糧的負(fù)對(duì)照組和試驗(yàn)1組均顯著降低了糞氮、尿氮和總氮的排放（P＜0.05），試驗(yàn)2組顯著降低了尿氮和總氮的排放（P＜0.05）。與負(fù)對(duì)照相比，添加BCAAs的T1組和T2組均顯著提高了氮沉積，并能夠恢復(fù)正對(duì)照水平。如圖2
圖2：低蛋白日糧添加BCAAs對(duì)仔豬氮平衡的影響
正對(duì)照組宰前活重顯著高于負(fù)對(duì)照組（P＜0.05），其他胴體性狀指標(biāo)在數(shù)值上高于負(fù)對(duì)照組，未達(dá)到顯著水平。與負(fù)對(duì)照組相比，添加BCAAs的T1組和T2組均顯著提高了宰前活重、左半胴體重、眼肌面積、前、中和后驅(qū)肌肉重以及肌肉總重（P＜0.05）。如表3
表3：低蛋白日糧添加BCAAs對(duì)仔豬胴體性狀的影響
結(jié) 論
低蛋白日糧（CP 為 17%）添加 BCAAs 可以提高采食量以及直接促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，從而改善仔豬生長(zhǎng)性能及日糧氮沉積，并能恢復(fù)到飼喂 CP 為20%日糧的水平。
參考文獻(xiàn)： 鄭溜豐.低蛋白日糧添加支鏈氨基酸對(duì)仔豬采食量和骨骼生長(zhǎng)的影響及調(diào)控機(jī)制研究:[博士學(xué)位論文]. 武漢.華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017
《低蛋白日糧添加支鏈氨基酸對(duì)仔豬采食量和骨骼生長(zhǎng)的影響及調(diào)控機(jī)制研究》
【作 者】鄭溜豐
【學(xué)位授予單位】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位名稱】博士
【導(dǎo)師姓名】彭健
【學(xué)位年度】2017
【關(guān)鍵詞】仔豬；低蛋白日糧；支鏈氨基酸；采食量；骨骼肌生長(zhǎng)；蛋白質(zhì)合成與降解；氨基酸代謝
【摘 要】
充足的底物濃度和平衡的氨基酸模式是豬骨骼肌高效蛋白質(zhì)合成的必要條件。其中,采食量是保障充足的底物濃度的關(guān)鍵。除作為合成蛋白質(zhì)底物外,支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）可能還發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用。比如,纈氨酸能夠調(diào)控豬采食量。此外,幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸以及大部分谷氨酰胺在腸道發(fā)生了分解代謝,導(dǎo)致不可逆的損失。骨骼肌蛋白質(zhì)合成所需的這三個(gè)非必需氨基酸必須要由BCAAs代謝生成。而且BCAAs僅有部分被腸道和肝臟等器官截留。因此,通過日糧中添加BCAAs可能增加骨骼肌內(nèi)自身代謝生成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸,優(yōu)化胞內(nèi)氨基酸模式,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。目前已有的研究表明,日糧添加BCAAs可以提高豬生長(zhǎng)性能,但其對(duì)采食量及骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。
本研究圍繞BCAAs提高仔豬采食及骨骼肌生長(zhǎng)的關(guān)鍵問題,通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)了低蛋白日糧添加BCAAs通過提高采食量和直接促進(jìn)肌肉生長(zhǎng),改善仔豬生長(zhǎng)性能,并進(jìn)一步闡明了下丘腦感應(yīng)BCAAs調(diào)節(jié)仔豬采食量的機(jī)制。應(yīng)用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù),研究了日糧BCAAs對(duì)攝食狀態(tài)下骨骼肌的氨基酸凈利用及代謝的影響,并探究了BCAAs代謝與肌肉氨基酸凈利用的關(guān)系;應(yīng)用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù),進(jìn)一步闡明了BCAAs通過自身代謝調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機(jī)制。最后研究了日糧BCAAs對(duì)禁食狀態(tài)下骨骼肌內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解的信號(hào)通路活性的影響。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
第一部分:通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)研究了低蛋白日糧添加BCAAs對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、采食量及骨骼肌生長(zhǎng)的影響。
在試驗(yàn)一中,選取28頭斷奶仔豬分為4個(gè)組,即正對(duì)照組、負(fù)對(duì)照組、試驗(yàn)1組以及試驗(yàn)2組,日糧粗蛋白水平依次為19.5%、16.7%、16.7%和17.2%。其中,試驗(yàn)1組在負(fù)對(duì)照組基礎(chǔ)上添加纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸保證日糧中三種BCAAs水平與正對(duì)照組一致,并增加一倍的添加劑量形成試驗(yàn)2組的日糧。自由采食。
試驗(yàn)二為配對(duì)試驗(yàn),選取21頭斷奶仔豬分為3個(gè)組,即負(fù)對(duì)照組、試驗(yàn)1組以及配對(duì)組。其中,負(fù)對(duì)照組和試驗(yàn)1組同試驗(yàn)一。配對(duì)組試豬飼喂試驗(yàn)1組的日糧,但采食量與負(fù)對(duì)照組保持一致。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇6頭屠宰,測(cè)定胴體性狀,采集下丘腦及背最長(zhǎng)肌樣。同時(shí),剝離背最長(zhǎng)肌等主要的23塊肌肉,分別稱量肌肉塊重量。
主要結(jié)果如下:
1.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著提高了平均日增重、末重、采食量、前軀、中軀和后軀肌肉總重、背最長(zhǎng)肌等大多數(shù)肌肉塊重量以及氮沉積（P<0.05）,并能恢復(fù)到正對(duì)照組的水平。當(dāng)采食量保持一致時(shí),添加BCAAs的配對(duì)組仍能顯著提高仔豬平均日增重和肉料比（P<0.05）,并也顯著提高了岡上肌、背闊肌、背最長(zhǎng)肌等大塊肌肉重量（P<0.05）。
2.與負(fù)對(duì)照組相比,日糧添加BCAAs以劑量依賴的方式上調(diào)下丘腦Agrp和NPY mRNA水平,下調(diào)MC4R mRNA水平,并在試驗(yàn)2組達(dá)到差異顯著水平（P<0.05）。此外,試驗(yàn)1組顯著下調(diào)了CART mRNA水平（P<0.05）�；貧w分析顯示,采食量隨NPY mRNA水平增加呈二次曲線增加（P=0.02）,而隨MC4R mRNA水平增加呈線性降低（P=0.02）。表明日糧添加BCAAs對(duì)采食量的提高與其上調(diào)下丘腦NPY基因表達(dá)以及下調(diào)MC4R基因表達(dá)有關(guān)。
3.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著降低了下丘腦eIF2α磷酸化水平,以及顯著提高了S6K1磷酸化水平（P<0.05）,并能恢復(fù)到正對(duì)照組的水平。此外,試驗(yàn)1組的mTOR磷酸化水平顯著高于負(fù)對(duì)照組（P<0.05）。表明日糧添加BCAAs對(duì)采食量的提高與其降低GAAC通路活性以及提高mTORC1通路活性有關(guān)。
4.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和配對(duì)組均顯著提高了背最長(zhǎng)肌S6K1和mTOR磷酸化水平（P<0.05）,但試驗(yàn)1組和配對(duì)組之間差異不顯著。說明BCAAs能夠激活骨骼肌mTORC1通路活性,且不依賴于采食量的變化。
第二部分:利用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究了日糧添加BCAAs對(duì)仔豬肌肉氨基酸凈利用和股靜脈代謝產(chǎn)物譜的影響。試驗(yàn)動(dòng)物同第一部分的配對(duì)試驗(yàn)。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)負(fù)對(duì)照組及試驗(yàn)1組的試豬分別在股動(dòng)脈、股靜脈、頸動(dòng)脈和頸靜脈安裝插管。在術(shù)后的第5 d,每組各選擇6頭健康且插管通暢的試豬進(jìn)行正式試驗(yàn)。通過股動(dòng)脈持續(xù)9 h灌注對(duì)氨基馬尿酸（pAH）以測(cè)定肌肉血流速度。每隔1 h飼喂以保持試豬始終處于攝食狀態(tài),連續(xù)飼喂8次。攝食前及攝食后每隔1 h分別采集頸動(dòng)脈和股靜脈血樣以供分析pAH、游離氨基酸及支鏈α酮酸,連續(xù)采集8次。待血樣采集完成后屠宰,采集股二頭肌樣用于游離氨基酸及3-甲基組氨酸分析,股靜脈血樣同時(shí)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。
主要結(jié)果如下:
1.肌肉血流速度在攝食后顯著提高了（P<0.05）,但不受日糧處理的影響。日糧添加BCAAs顯著增加了動(dòng)脈和肌肉游離的異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸濃度（P<0.05）,但顯著降低了動(dòng)脈游離的苯丙氨酸和絲氨酸濃度以及肌肉游離的絲氨酸濃度（P<0.05）。同時(shí),添加BCAAs顯著降低了肌肉游離的3-甲基組氨酸濃度（P<0.05）,表明BCAAs抑制骨骼肌蛋白質(zhì)動(dòng)員。
2.日糧添加BCAAs顯著提高了總BCAAs、總必需氨基酸、總非必需氨基酸及總氨基酸的肌肉凈利用量（P<0.05）,從而維持高效的蛋白質(zhì)沉積。此外,添加BCAAs顯著增加了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸及其代謝產(chǎn)物丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的肌肉凈利用量（P<0.05）,同時(shí)還顯著增加了組氨酸、蛋氨酸以及甘氨酸、脯氨酸和絲氨酸等功能性非必需氨基酸的肌肉凈利用量（P<0.05）。
3.日糧添加BCAAs對(duì)股靜脈代謝物有顯著影響,這些差異化合物與BCAAs代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)。例如,添加BCAAs顯著提高了三種支鏈α酮酸、谷氨酰胺以及天冬酰胺等代謝產(chǎn)物含量（P<0.05）;同時(shí)也顯著提高了二十碳五烯酸等脂質(zhì)代謝相關(guān)產(chǎn)物含量（P<0.05）。進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)物定量的結(jié)果顯示,添加BCAAs顯著提高了KIC和KMV（分別為亮氨酸和異亮氨酸的轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物）的肌肉凈生成量（P<0.05）,提示添加BCAAs增加了骨骼肌內(nèi)自身的代謝。
4.肌肉氨基酸凈利用量分別與動(dòng)脈的亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）,而與肌肉的BCAAs濃度之間無相關(guān)性。有趣的是,肌肉氨基酸凈利用量分別與KIC和KMV凈生成量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。這些結(jié)果暗示添加BCAAs可能通過增加動(dòng)脈濃度及胞內(nèi)自身代謝來提高肌肉氨基酸凈利用量。
第三部分:利用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)研究了日糧BCAAs通過調(diào)控自身代謝影響仔豬骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解的機(jī)制。攝食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動(dòng)物同第二部分試驗(yàn)。在試豬第一次采食完,通過頸靜脈灌注NaH13CO3,持續(xù)2 h。隨后灌注[1-13C]亮氨酸,持續(xù)6 h。pAH灌注以及血樣采集同第二部分試驗(yàn)。血樣用于分析亮氨酸、KIC和CO2濃度及其同位素豐度。禁食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動(dòng)物同第一部分試驗(yàn)的試驗(yàn)一。采集負(fù)對(duì)照組和試驗(yàn)1組的背最長(zhǎng)肌樣。
主要結(jié)果如下:
1.日糧添加BCAAs顯著提高亮氨酸的動(dòng)脈攝入量和凈利用量（P<0.05）,從而顯著提高蛋白質(zhì)合成量以及沉積量（P<0.05）。添加BCAAs也顯著增加凈轉(zhuǎn)氨量（P<0.05）,但不影響氧化脫羧量。有趣的是,蛋白質(zhì)降解在添加BCAAs后亦顯著增加了（P<0.05）。進(jìn)一步的代謝命運(yùn)分析顯示,肌肉攝取亮氨酸約有30%發(fā)生代謝,并主要經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成KIC。
2.肌肉的[1-13C]亮氨酸凈攝取以及[1-13C]KIC凈生成在日糧添加BCAAs后也顯著提高了（P<0.05）。相關(guān)分析顯示,骨骼肌蛋白質(zhì)合成分別與蛋白質(zhì)降解及[1-13C]KIC凈生成之間呈顯著正相關(guān)（P<0.05）,暗示日糧BCAAs可能通過增加蛋白質(zhì)降解以及自身的轉(zhuǎn)氨代謝,提高攝食狀態(tài)下蛋白質(zhì)合成。
3.日糧添加BCAAs顯著提高了背最長(zhǎng)肌的Akt、mTOR及其下游靶蛋白S6K1的磷酸化水平（P<0.05）,提示飼喂BCAAs仔豬在禁食狀態(tài)下骨骼肌具有更高的蛋白質(zhì)合成能力。此外,添加BCAAs顯著增加了FoxO1磷酸化水平（P<0.05）,相應(yīng)地下調(diào)了Atrogin-1、MuRF1以及LC3-II蛋白的表達(dá)（P<0.05）,提示飼喂BCAAs仔豬在禁食狀態(tài)下骨骼肌呈現(xiàn)更低水平的蛋白質(zhì)降解。
本研究的主要結(jié)論為:
（1）低蛋白日糧添加BCAAs可以提高采食量以及直接促進(jìn)肌肉生長(zhǎng),從而改善仔豬生長(zhǎng)性能,并能恢復(fù)到飼喂高蛋白日糧的水平;
（2）日糧BCAAs可以通過影響下丘腦的食欲調(diào)節(jié)基因表達(dá)及通路活性,提高采食量;
（3）日糧BCAAs通過促進(jìn)自身在肌細(xì)胞內(nèi)的代謝以及蛋白質(zhì)降解,進(jìn)而增加氨基酸凈利用量,提高攝食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率;同時(shí),日糧BCAAs通過下調(diào)泛素-蛋白酶體以及自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵蛋白表達(dá),抑制禁食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)降解,并最終提高蛋白質(zhì)沉積,從而促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)。
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