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2.抗體檢測技術
CSF抗體水平檢測是疫苗免疫效果評價的主要方法，ELISA方法以其操作簡便、敏感、檢測樣本量大等優(yōu)點成為其主要手段。目前市場上眾多的ELISA試劑盒，檢測效果最好和最穩(wěn)定的仍是進口試劑盒，尤其是idexx公司的CSF抗體檢測試劑盒，因此研發(fā)國產(chǎn)化的準確度高的CSF抗體ELISA檢測試劑盒勢在必行。我們采用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得CSFVE2基因可溶性表達產(chǎn)物(專利受理書編號200810223406.0)，突破了診斷用抗原的關鍵制備技術：對單抗WH303進行純化和FITC標記。分別建立了CSF間接ELISA方法和阻斷ELISA方法�？贵w間接ELISA方法：采用中和實驗作為金標準與間接ELISA對232個陽性樣本和242個陰性樣本進行符合實驗，其敏感性符合率為90.95% ，特異性符合率為94.21%，兩種方法的總符合率為92.62%。該方法具有操作簡便，靈敏度高等特點，通過對血清中E2蛋白多抗的檢測，可全面反應豬體內抗體水平，適用于田間大規(guī)模免疫抗體水平普查、商品豬場免疫效果評價和不同免疫水平豬群的分群�？贵w阻斷ELISA檢測方法：對PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗體(CSF抗體為陰性)無交叉反應。對285份臨床血清樣本的檢測結果表明，與IDEXX試劑盒的特異性為94.2%，敏感性為98%。兩種方法的符合性為97.5%。由于采用單抗WH303作為酶標抗體，大大了降低非特異性反應。通過與idexx試劑盒比較，兩種試劑盒檢測效果相近。該方法除用于田間大規(guī)模普查外，尤其適用于規(guī)�；N豬場和重點疫區(qū)抗體監(jiān)測。制備成本較低，穩(wěn)定性好，為我國CSF抗體水平的監(jiān)測提供了重要的技術支持。
三、建立了豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的研究
豬瘟兔化弱毒株是世界公認的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我國唯一使用的豬瘟疫苗毒株。家兔熱反應是疫苗效價測定和成品效力檢驗的主要方法，難免檢測結果準確性不佳，主要與實驗動物個體差異和標準化程度不高、檢測周期長有關，無疑提高了疫苗儲藏成本，滯后了疫苗上市時間。必須對現(xiàn)有檢測方法進行標準化研究，同時還必須采用新技術，建立新的準確簡便的替代方法，提高疫苗檢測質量，對其質量監(jiān)控至關重要。我們建立了HCLV熒光定量PCR方法(HCLV-FQ-PCR)，為疫苗兔熱效檢代替方法研究奠定了基礎，能定量檢測HCLV的病毒滴度，為疫苗效力檢驗提供了一種快速、敏感、特異的方法。同時還建立了CSFV單抗WH303直接免疫熒光檢測方法，該方法特異性好，比熒光多克隆抗體更敏感，熒光背景值較低，更容易觀察結果。對34份CSF疫苗同時進行兔熱反應、HCLV-FQ-PCR檢測、TCID50測定，發(fā)現(xiàn)三者之間存在良好的相關性，用HCLV-FQ-PCR及/或TCID50測定可以指導CSF疫苗的生產(chǎn)，對熒光定量CT值在17.10-20.81，病毒含量在8.27×104copy/μL-1.11×106copy/μL：或TCID50值在10-2.88/0.1ml-10-4.54/0.1ml之間的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100萬個兔體定型熱反應進行配苗。采用HCLV-FQ-PCR方法及CSF單克隆抗體直接免疫熒光方法測定疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)品的效價，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兔熱反應方法，從而更準確、快速指導疫苗的生產(chǎn)，縮短疫苗生產(chǎn)周期，節(jié)約生產(chǎn)成本，產(chǎn)生更明顯的經(jīng)濟和社會效益。
牛病毒性腹瀉病毒也稱牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BoVine Viral Diarrhea-Mucosal Disease Virus，BDV-MDV)，在分類學上屬于黃病毒科(FlaViViridae)瘟病毒屬。國內外已有相關報道表明犢牛血清中存在BVDV污染，造成仔豬BVDV先天性感染，出現(xiàn)CSF類似癥狀與病變。所以在CSF細胞疫苗生產(chǎn)過程中，對原材料中BVDV檢測是必不可少的。我們建立了BVDV-FQ-PCR方法，該方法只擴增BVDV，不擴增BVDV以外病原，與RT-PCR符合率為99.1%。通過對58份不同廠家不同批次的CSF疫苗半成品進行檢測發(fā)現(xiàn)，污染率達20.7%：對不同廠家不同批次36份CSF成品檢測發(fā)現(xiàn)污染率高達22.2%。具有快速、敏感、特異的特點，為CSF疫苗原材料BVDV污染檢測提供了技術支持，保障CSF疫苗的質量。
四、豬瘟病毒致病機制及標記疫苗的研究
CSFV的3’UTR被認為與病毒基因組的復制、翻譯以及復制和翻譯的調控有關，序列比對發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的3’UTR核苷酸的第61位有一個12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，這在強毒SM株以及其它毒株中是沒有的。為研究這一特征性序列的生物學功能，特別是HCLV在減毒中是否發(fā)揮了重要作用，構建兩個突變株感染性cDNA克隆，一株是在強毒SM株基因組pT7SM感染性cDNA克隆3’UTR的第61 位處插入了12個堿基“CTTTTTTCTTTT”，定名為pT7SM3’-+12：另一個是pT7SM的3’UTR完全被HCLV基因組3’UTR所替換，名為pT7SM3’-239。經(jīng)拯救得到兩株突變株病毒VT7SM3′-+12和VT7SM3′-239，分別在細胞和動物水平研究了突變株病毒的增殖特性和毒力變化情況。結果兩個突變株在PK-15細胞上的病毒增殖滴度比其親本株下降了約100倍：對實驗用豬產(chǎn)生了明顯減毒的現(xiàn)象，有效地誘導宿主產(chǎn)生中和抗體，并可以使宿主完全抵抗致死劑量的SM強毒的攻擊，這種特性和HCLV十分類似。表明HCLV 3’UTR的 12個堿基插入對CSFV復制和毒力有著重要影響，與疫苗減毒有重要關系。該結果也提示CSFV的非編碼區(qū)突變可以影響病毒的毒力，這對理解CSFV的減毒機理以及開發(fā)新一代疫苗提供理論依據(jù)。
由于HCLV接種豬與自然感染豬不能從血清學上予以區(qū)分，我國CSF防控實行的是強制免疫措施，開發(fā)CSF標記活疫苗對于我國CSF凈化和參與國際貿易具有現(xiàn)實意義。我們運用反向遺傳操作技術，在實驗室已構建的C株感染性克隆的基礎上，在E1的C末端插入FLAG基因作為標記分子，構建含有FLAG基因的豬瘟兔化弱毒標記毒株VC-FLAG的感染性克隆，并成功拯救出含有FLAG標記的VC-FLAG病毒。通過病毒的細胞適應性實驗，證明VC-FLAG病毒可以適應多種豬源細胞，證明了SK6細胞系是培養(yǎng)VC-FLAG的最適細胞系，探索出了使用帶毒細胞混合正常細胞進行傳毒的病毒傳代方法。不同代次病毒經(jīng)免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測定證明嵌合病毒能穩(wěn)定表達標記抗原，且在細胞中傳代的遺傳穩(wěn)定性良好，為CSF標記疫苗研究奠定了基礎。
五、國際合作交流成就
歐洲也是CSF流行的一個重要區(qū)域，在CSF的研究中處于領先地位。幾年來，我們加強和歐洲的交流及合作，提升了科技創(chuàng)新能力，解決CSF準確診斷的關鍵問題：建立了良好的國際合作渠道，提升了該實驗室的國際地位，建立并完善我國系列CSF診斷技術，進而改進和完善我國CSF預防控制策略。
應歐盟CSF參考實驗室邀請，我們連續(xù)2年每年參加歐盟CSF參考實驗室組織的來自42個國家50個實驗室的CSF年會和診斷比對實驗，掌握了歐洲CSF流行現(xiàn)狀，分析歐盟CSF防控技術對我國的影響，對我國CSF防控乃至凈化具有很好的推動作用。采用本實驗室建立的CSFV通用熒光RT-PCR方法、CSFV鑒別熒光MGB-RT-PCR方法和CSFVRT-nPCR方法，對歐盟CSF參考實驗室在2009年提供的18個和2010年提供的16個病原盲樣進行檢測，結果與歐盟CSF參考實驗室完全一致：采用本實驗室建立的CSF抗體間接ELISA和CSF抗體阻斷ELISA方法，對上述盲樣進行檢測，僅間接ELISA對一個盲樣反應結果為陰性或可疑，其余樣本完全符合。2次國際比對、國內比對以及我們的大量實驗結果顯示，我們研制的系列方法彌補了我國CSF病原檢測的空白，組裝的CSF病原檢測試劑盒相關指標達到歐盟參考實驗室技術標準，抗體檢測試劑盒相關指標達到了進口商品化試劑盒的標準，相關成果已申請專利保護，正申請新獸藥臨床試驗�？蓪崿F(xiàn)CSF病原檢測和CSF抗體檢測試劑盒的國產(chǎn)化，提升我國CSF診斷水平，為獲得國際貿易認可鋪平了道路，為CSF防控和凈化掃清了障礙，具有很好的推廣應用前景和極大的產(chǎn)業(yè)化價值。
六、豬瘟凈化策略研究
CSF是我國政府計劃要根除的重要傳染病，近年來對科研投入資金力度逐年加強。因此，我們通過十年堅持不懈地研究，取得了上述成就，提升了我所CSF研究在國際上的影響力。上述一切工作的最終目的，是為我國CSF防控與凈化鋪墊基礎。在我們主持的十一五支撐計劃《豬瘟、豬偽狂犬病綜合防空集成與示范》的支撐下，在華中農業(yè)大學、四川農業(yè)大學、軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所、中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所及湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所等國內CSF及豬偽狂犬病研究處于領先地位的6個研究單位的共同努力下，課題組在15個規(guī)�；B(yǎng)豬示范場開展了CSF及豬偽狂犬病的綜合控制及凈化工作，最終使9個場凈化了CSF，取得了顯著的成效。(注：本項報告僅涉及CSF凈化)
在上述技術集成的基礎上，按照準備階段→控制階段→強制凈化階段→監(jiān)測階段→認證階段等五個凈化程序，通過對CSF快速診斷試劑盒、疫苗毒株和致病毒株鑒別診斷方法的篩選和整合，免疫程序的調整，生物安全措施的綜合實施。根據(jù)病原污染程度，將示范場分為嚴重污染場和一般污染場實施凈化。對CSF嚴重污染場，CSF病原陽性率分別從2006年的7.08%～11.49%下降至2010年的0%～2.07%，達到基本清除CSF的目標：對CSF一般污染場，陽性率分別從0.87%～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率總體上升，從2006年的67.30%～90.67%上升至2010年的85.00%～96.32%。達到了基本無疫或無疫，成功地在部分種豬場實現(xiàn)了CSF的控制與凈化，建立了不同凈化模式。
示范場生產(chǎn)指標得到了全面改善，經(jīng)濟效益穩(wěn)步提升，如湖北省二場三場從虧損32萬元到2010年贏利60.1萬元，北京養(yǎng)豬育種心從2007年贏利120萬元至2009年贏利520萬元。同時，開展各個層次針對性技術培訓，組建專門的凈化技術組，提升了養(yǎng)豬場的理論水平和疫病防控能力。通過近3年在15個示范場CSF的綜合防控及凈化，構建了符合我國國情的規(guī)模化豬場CSF和豬偽狂犬病的不同凈化模式，形成了一系列的指導方案，制定了《規(guī)�；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術集成與示范實施方案》、《規(guī)模化豬場豬瘟凈化技術指南》、《集約化、規(guī)�；i場生物安全體系的實施方案》和《“豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術集成與示范”課題種豬凈化認證方案建議》等指南，取得的重要創(chuàng)新性成果，可用于指導我國CSF的防控和凈化。
結語：
CSF困擾我國養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)半個多世紀，目前依然是各級政府計劃要根除的重大豬病。通過我們十年的流行病學研究，發(fā)現(xiàn)CSF的病毒基因組比較穩(wěn)定，變異的頻率較低，且只有一個血清型，這對該病毒的清除是一個有利的條件。更為重要的是，我們研發(fā)的診斷技術已經(jīng)達到國際技術標準，并被國際上認可。數(shù)據(jù)還表明由我國的CSF疫苗依然是最優(yōu)秀的疫苗，為CSF的控制和根除提供了技術保障。尤其是十一五期間對我國部分養(yǎng)豬場凈化CSF的成功先例表明，現(xiàn)階段在我國目前的流行狀態(tài)下，在規(guī)�；i場和部分區(qū)域開展CSF的凈化是完全可行的。
