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本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬瘟的檢疫。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
GB 16548-1996 畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程
3 群體檢疫
3.1經(jīng)核實(shí)已按規(guī)定接種合格的豬瘟疫苗，注射后一月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的患豬，并處在免疫有效期內(nèi)，可認(rèn)為免疫符合要求。如未接種疫苗，或接種不符合要求，或接種后又發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的病豬，必須進(jìn)行補(bǔ)充免疫接種，至免疫有效期開始未發(fā)生異常，或認(rèn)為免疫合格；如免疫接種后再發(fā)生疑似豬瘟患豬，必須進(jìn)行臨床檢查、解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，在排除豬瘟染疫的可能性之后，方可認(rèn)為免疫合格
3．2檢查全群的健康狀況，有否異常表征。如發(fā)現(xiàn)豬群中被檢豬只體溫在40.5℃以上，倦怠、食欲不振、精神萎頓，可視粘膜充血、出血或有不正常分泌物、發(fā)紺、便秘腹瀉交替，或其他疑似豬瘟的癥狀，作可疑豬瘟對(duì)待，全群隔離飼養(yǎng)，作進(jìn)一步診斷。
此外，仔豬有衰弱、震顫或發(fā)育不良等現(xiàn)象時(shí)，可懷疑母豬攜帶豬瘟病毒，應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。
3．3對(duì)群體中檢出的可疑患豬可抽樣進(jìn)行解剖檢查，下述病變作為綜合診斷定性的依據(jù)之一：
a．腎皮質(zhì)色澤變淡，有點(diǎn)狀出血；
b．淋巴結(jié)外觀充血腫脹，切面周邊出血，呈紅白相間的“大理石樣”；
c．脾臟不腫長(zhǎng)，邊緣發(fā)現(xiàn)楔狀梗死區(qū)；
d．喉頭、膀胱有小點(diǎn)出血；
e．全身出血性變化，多呈小片或點(diǎn)狀；
f．回盲瓣、回腸、結(jié)腸形成“鈕扣狀腫”（慢性豬瘟）；
g．公豬包皮積尿。
3．4經(jīng)檢疫認(rèn)為免疫合格，臨床檢查無異常；或發(fā)現(xiàn)疑似病例，經(jīng)解剖檢查、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)等綜合性診斷，證明不是豬瘟，應(yīng)作為非豬瘟群對(duì)待。但易地飼養(yǎng)時(shí)，必須先隔離兩周以上，經(jīng)觀察無異常方準(zhǔn)與當(dāng)?shù)刎i群混養(yǎng)。
4個(gè)體檢疫
豬只作為單個(gè)檢疫對(duì)象時(shí)，應(yīng)進(jìn)行認(rèn)真的個(gè)體檢疫。
4．1個(gè)體檢疫的內(nèi)容包括：
a．查明產(chǎn)地有否疫情或查驗(yàn)產(chǎn)地檢疫證明；
b．查驗(yàn)防疫證明；
c．臨床檢查。
4．2如上述三項(xiàng)均無疑問，可作為豬瘟非疫豬對(duì)待。
4．3如4.1c項(xiàng)無問題，而4.1a、兩項(xiàng)有問題，可再次補(bǔ)充免疫接種，隔離15日無異常按非豬瘟豬對(duì)待。如免疫后有可疑癥狀，應(yīng)繼續(xù)隔離觀察，如仍不能確診，須進(jìn)行解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
4． 4如4.1a、b兩項(xiàng)無問題，4.1c項(xiàng)有問題應(yīng)隔離觀察，如仍不能確診，須作解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
5實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)
5． 1有下列情形之一者應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)：
a．產(chǎn)地定期檢疫；
b．非疫區(qū)對(duì)從外地引進(jìn)的豬進(jìn)行全群檢查或抽檢；
c．發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟患豬或“非典型豬瘟”，母豬繁殖障礙和仔豬先天性痙攣病例須予確診；
d．原認(rèn)為非疫群中或從非疫區(qū)引進(jìn)豬群中發(fā)現(xiàn)可疑豬瘟或病毒攜帶者，須予確診；
e．發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟暴發(fā)流行，在采取緊急防治措施的同時(shí)須作出確切診斷，或解除封鎖前須查明豬體帶毒情況；
f．有重大疫�。ㄈ绶侵挢i瘟）嫌疑須作出鑒別診斷；
g．交易雙方共同要求，或農(nóng)牧主管部門要求進(jìn)行確診；
h．經(jīng)群體檢疫或個(gè)體檢疫，需要進(jìn)一步確診者。
5．2下述方法，其試驗(yàn)結(jié)果可作為檢疫定性的依據(jù)之一。
5．2．1兔體交叉免疫試驗(yàn)，見附錄A（補(bǔ)充件）。
5．2．2免疫酶染色試驗(yàn)，見附錄A（補(bǔ)充件）。
5．2．3病毒分離與增毒試驗(yàn)，見附錄C（補(bǔ)充件）。
5．2．4直接免疫熒光抗體試驗(yàn)，見附錄D（補(bǔ)充件）。
6綜合判定
發(fā)病不分年齡、季節(jié)，臨床癥狀明顯，解剖檢查病變典型，用5.2中任一試驗(yàn)獲陽性結(jié)果；或臨床癥狀和發(fā)病情況不詳，尸體解剖檢查變典型，5.2中所列任一試驗(yàn)獲陽性結(jié)果；發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化不詳、不明顯或不典型，但5.2中所列試驗(yàn)的兩項(xiàng)獲陽性結(jié)果；這些情況均可判定為豬瘟毒感染豬。
7檢疫后處理
在群體或個(gè)體檢疫中，凡經(jīng)綜合判定為豬瘟者，其群體或個(gè)體一律GB 16548處理。
附錄A
兔體交叉免疫試驗(yàn)
（補(bǔ)充件）
將病豬的淋巴結(jié)和脾臟，磨碎后用生理鹽水作1：10稱釋，對(duì)3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另設(shè)3只不注射病料的對(duì)照兔，間隔5d對(duì)所有家兔靜脈注射1：20的豬瘟兔化病毒（淋巴脾臟毒），1mL/只，24h后，每隔6h測(cè)體溫一次，連續(xù)測(cè)96h，對(duì)照組2/3出現(xiàn)定型熱或輕型熱，試驗(yàn)成立。試驗(yàn)組的試驗(yàn)結(jié)果判定見表A1。
表A1兔體交叉疫試驗(yàn)結(jié)果判定
接種病料后體溫反應(yīng) 接種豬瘟兔化弱毒后體溫反應(yīng) 結(jié)果判定
- - 含豬瘟病毒
- + 不含豬瘟病毒
+ - 含豬瘟兔化病毒
[FS:PAGE]+ + 含非豬瘟病毒熱原性物質(zhì)
注：“+”表示多于或等于三分之二的動(dòng)物有反應(yīng)。
附錄B
免疫酶染色試驗(yàn)
（補(bǔ)充件）
B1 解剖檢查時(shí)采病畜扁桃體、脾、腎、淋巴結(jié)作壓印片或冰凍切片。標(biāo)本自然干燥后，在2%戌二醛和甲醛等量混合液中固定10min，干后，置冰箱內(nèi)待檢。
操作方法
B1.1 將標(biāo)本浸入0.01%過氧化氫或0.01%迭氮鈉的Tris-HCL緩沖液中，室溫下作用30min.
B1.2 用PH7.4 0.02mol/L磷酸緩沖鹽水漂洗5次，每次3min,風(fēng)干。
B1.3 將標(biāo)本置于濕盒內(nèi)，滴加1：10酶標(biāo)記抗體，覆蓋標(biāo)本面上，置37℃作用45min.
B1.4 用PH7.40.02mol/L磷酸緩沖鹽水-1%吐溫緩沖液漂洗5次，每次2~3min.
B1.5 將標(biāo)本放入DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCL液內(nèi)，置37℃溫箱作用3 min.
B1.6 用PH7.40.02mol/L磷酸緩沖鹽水沖洗3~4次，每次2~3 min.，再用無水灑精、二甲苯脫水，封片檢查。
B1.7 用顯微鏡檢查，如細(xì)胞染成深褐色為陽性；黃色或無色為陰性。豬瘟兔化弱毒接種的豬組織細(xì)胞漿成微褐色，與強(qiáng)毒侏感染有明顯區(qū)別。
附錄C
病毒分離與增毒試驗(yàn)
（補(bǔ)充件）
本試驗(yàn)可用來分毒和擴(kuò)增病毒數(shù)量以提高檢疫的敏感性。
C1 將2g扁桃體或脾臟，剪成小塊，加上滅菌砂在乳缽中研成勻漿。用Hank"s液或MEM配成20%懸液，加上青霉素（使終濃度為500單位/mL）和鏈霉素（使終濃度為500μg/mL），室溫下放置1h，3000r/min離心15min，取用上清液。
C2 將PK15單層細(xì)胞用胰酶消化分散后，800r/min離心10min，用含無BVDV的5%胎牛血清的MEM配成2×106個(gè)細(xì)胞/mL懸液。
C3 9份細(xì)胞懸液(C2)加1份病料懸液(C1)接種于轉(zhuǎn)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板。另設(shè)不加病料的對(duì)照若干瓶（孔），于接種后1、2、3d.分別將2瓶（孔）培養(yǎng)物及1瓶（孔）對(duì)照用Hank"s液或BVDV洗滌2次，每次5 min，用冷丙酮固定10 min.
C4 進(jìn)行免疫酶染色或免疫熒光染色，鏡檢。
附錄D
直接免疫熒光抗體試驗(yàn)
（補(bǔ)充件）
D1采樣
群體檢疫中，待檢可疑豬不少于三例，其中至少二例為早期患豬，剖殺后或從活體摘取口腭扁桃體。后期病豬剖殺后采扁桃體和腎臟。個(gè)體檢疫中，剖殺可疑豬采扁桃體和腎臟。所采組織樣品必須新鮮。
D2送檢
采樣后應(yīng)盡快送檢，如當(dāng)日不能送出，必須凍結(jié)保存，避免組織腐敗、自溶。
D3切片
將樣品組織塊修切出1cm×1cm的面，不經(jīng)任何固定處理，直接凍貼于冰凍切片托上（組織塊太小時(shí)，如活摘的扁桃體可用冰凍切片機(jī)專用的包埋劑或化學(xué)漿糊包埋）,進(jìn)行切片。切片厚度要求5~7μm。將切片展貼于0.8~1mm厚的潔凈載玻片上。
D4固定
將切片置純丙酮中固定15 min，取出立即放入0.01mol/L，PH7.2的磷酸緩沖鹽水中，輕輕漂洗3~4次。取出，自然干燥后，盡快進(jìn)行熒光抗體染色。
D5熒光抗體染色
將豬瘟熒光抗體滴加于切片表面，置濕盒內(nèi)于37℃作用30 min。取出后放入磷酸緩沖鹽水中充分漂洗，再用0.5 mol/L，PH9.0~9.5碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片（0.17 min厚）。染色后應(yīng)盡快鏡檢。必要時(shí)可低溫保存待檢。
D6鏡檢
將染色后的切片標(biāo)本置激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。
D7判定
于熒光顯微鏡視野中，見扁桃體隱窩上皮細(xì)胞或腎曲小管上皮細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，判為豬瘟病感染陽性。
附加說明：
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。
本標(biāo)準(zhǔn)全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所負(fù)責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人楊承諭、鄭志剛、仰惠芬、邵振華。
中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
