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1 母豬定時輸精技術
1.1 母豬定時輸精技術的研究背景
目前，國內外大多數(shù)豬場都是通過觀察母豬排卵規(guī)律、發(fā)情癥狀來確定授精時間，具有一定的盲目性。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，發(fā)情配種后的母豬產(chǎn)仔數(shù)差異較大，有的六七頭，有的十多頭。除品種、精液質量等原因外，授精技術也是重要的影響因素。母豬定時輸精技術能夠有效地把握最佳輸精時間，在一定程度減少母豬在每胎產(chǎn)仔數(shù)上的差異，同時也可以促進豬場批次化生產(chǎn)管理的實施。早在1974年，德國人Hunter在東歐開始采用這項技術作為管理措施，至今應用生產(chǎn)已超過40年。然而，該技術在美洲和亞洲的養(yǎng)豬場中推廣不夠廣泛，使用仍很少。在我國奶牛生產(chǎn)上，已經(jīng)成功使用促性腺激素釋放激素(GnRH)和氯前列烯醇(PG)誘導母牛卵巢排卵并實施定時輸精[1]，在養(yǎng)羊生產(chǎn)中也取得了良好效果[2];然而，在我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中鮮有應用。
1.2 定時輸精的原理
發(fā)情排卵是輸精的必要前提。母畜的發(fā)情排卵由體內GnRH、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)等激素水平逐步升高引起。對于后備母豬，隨著動物的出生，下丘腦就釋放GnRH，但GnRH、FSH和LH的合成與釋放對性腺類固醇類激素的負反饋極為敏感，結果達成一種維持性器官發(fā)育的低激素水平。隨著母畜的體成熟和性成熟，GnRH、FSH和LH的合成和釋放對性腺類固醇類激素的負反饋敏感性逐漸降低，同時垂體對GnRH的敏感性逐步提高，形成高水平的激素平衡，即形成后備母畜的初情期。對于經(jīng)產(chǎn)母豬，哺乳期間高濃度的催乳素抑制了下丘腦GnRH的釋放，哺乳期間不發(fā)情，斷奶后，由于沒有了仔豬對乳頭及乳房的強烈刺激，催乳素濃度迅速下降，解除了對下丘腦GnRH釋放的抑制作用，下丘腦開始有節(jié)律地釋放GnRH，GnRH促進垂體前葉釋放FSH—卵泡發(fā)育—成熟—產(chǎn)生的雌激素形成發(fā)情現(xiàn)象，同時雌激素促進GnRH-LH峰的形成，產(chǎn)生發(fā)情排卵現(xiàn)象(圖1)。
綜上所述，若要實施定時輸精，那么就需要同時釋放GnRH等關鍵激素。換言之，定時輸精技術就必須以GnRH為基礎，結合孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)等激素共同作用，最終使母豬卵泡發(fā)育同步化和排卵同步化，進而實施定時輸精。PMSG、HCG、GnRH等激素可促進母畜內源促性腺激素的釋放，使所有母豬發(fā)情周期調整到相同的階段。它是通過控制卵泡的生長發(fā)育和黃體期的長短來達到卵泡發(fā)育同步化的目的[3]。在斷奶母豬中，在母豬斷奶后24小時內注射PMSG使母豬卵泡發(fā)育同步化，經(jīng)72小時后再注射GnRH促使卵巢同步排卵，排卵時間為38～42小時。至于后備母豬，由于其性周期不一致或隱形發(fā)情，因此需要先飼喂四烯雌酮來達到延長黃體期使性周期同步的目的;隨后再注射PMSG促進卵泡發(fā)育同步化，72小時后再注射GnRH，使其排卵時間控制在40～46小時。雖然使用HCG、LH等激素也能使母豬發(fā)情，但實際上，使用GnRH促進母畜體內LH分泌更具有正常的生物學特性。通過GnRH促進FSH和LH協(xié)同分泌，具有促進卵泡最后成熟和排卵的作用，對提高排卵數(shù)、調整排卵時間以及排卵同步化具有決定性的作用。
1.3 定時輸精技術在母豬上的應用
早在1990年，前東德110萬頭母豬中，86%的母豬采用定時輸精技術。他們利用HCG/GnRH處理母豬，同期發(fā)情后24～40小時對母豬進行定時輸精，結果母豬的妊娠率、窩均產(chǎn)仔數(shù)等指標和常規(guī)人工授精的母豬相比，差異不顯著，但省去了鑒定母豬發(fā)情的過程[4]。
對于斷奶母豬，加拿大規(guī)�；i場研究表明，斷奶當天注射600 IU PMSG，80小時后再注射5 mg LH，然后分別在36小時和44小時各輸精1次，母豬的分娩率可從之前的69%提高到86%。在斷奶母豬中，GnRH必須在PMSG用藥后72小時進行處理，排卵時間在38～42小時之間，可在此時進行定時輸精(圖2)。對于后備母豬，相關研究結果表明，用GnRH處理后24小時和48小時各輸精1次，母豬的妊娠率可達到92% ～96%。但由于后備母豬的性周期不一致，因此需要先飼喂四烯雌酮來延長黃體期。此外，用1 000 IU的PMSG誘導180～210日齡的后備母豬發(fā)情是一種有效的技術方法，經(jīng)過處理的小母豬75%～90%會顯著發(fā)情，90%～100%會排卵。處理后前3天發(fā)情的很少，第4天是發(fā)情高峰，大多數(shù)后備母豬在處理后4～6天發(fā)情。85%～100%后備母豬在處理后的第96～144小時排卵。另外，據(jù)溫氏集團內部資料顯示，后備母豬在配種前發(fā)情的次數(shù)越多，其子宮的體積越大。因此，這是一種有效同步性周期的方法，同時能促進子宮發(fā)育，增加子宮體積，提高第1～2胎的產(chǎn)仔數(shù)。
1.4 定時輸精技術在母豬批次化管理上的應用
一般來說母豬斷奶幾天后，就會出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象，但由于母豬體內的激素水平不同，所以發(fā)情時間也不一致。使用人工注射性激素的方法讓母豬激素達到基本一致的水平，同時啟動發(fā)情周期，以實現(xiàn)定時輸精，達到母豬批次化生產(chǎn)的目的。由于哺乳天數(shù)不同，斷奶后母豬發(fā)情至排卵的間隔時間也會有所不同，所以在注射時要注意區(qū)分哺乳天數(shù)長于28天的斷奶母豬和哺乳天數(shù)少于28天的斷奶母豬(圖3)。
1.5 定時輸精技術的應用前景
定時輸精技術顯著縮短了母豬的非生產(chǎn)天數(shù)(NPD)，大大提高了母豬的利用率，是一個有效的繁殖管理辦法，它不僅大幅降低了配種員對查情和適時配種技術的素質要求，而且不會因為人員變動導致生產(chǎn)水平大幅起伏。如果能夠將母豬發(fā)情鑒定與定時輸精結合起來，將會在更大程度上提高母豬的配種率。同期發(fā)情和定時輸精技術處理后雖然排卵率增加，但是產(chǎn)仔數(shù)增加不多，可能是由子宮體積限制和早期胚胎死亡造成的。目前，我國定時輸精技術還不成熟，對利用不同劑量的PMSG和GnRH進行定時輸精來提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的研究還不夠深入，但毫無疑問的是，該技術是簡單有效的繁殖管理方法，有利于規(guī)模化豬場組織生產(chǎn)。
2 精子微膠囊技術
2.1 精子微囊技術的研究背景
最近幾十年，由于以人工授精為代表的繁殖技術在世界范圍內廣泛應用，母畜的生產(chǎn)力和繁殖力達到了較高水平。然而，豬人工授精技術仍然面臨諸多問題和困難，其中包括以下兩個方面：第一，因母豬生殖易受各方面不確定因素的影響(如季節(jié)、胎次)，所以單次輸精的結果并不令人滿意[5];第二，精子細胞膜在15℃以下時對冷凍低溫的抵抗力非常脆弱，同時標準的精液稀釋過程會使精液中精子的保護蛋白濃度、抗氧化分子濃度及細胞內分子濃度降低，產(chǎn)生“精子稀釋休克”反應[6]。鑒于以上問題，能夠減少輸精劑量、可以實施單次人工輸精的精子微膠囊技術應運而生。
精子微膠囊技術是在保持精子正常生理代謝和授精能力的同時，應用高分子聚合材料將原精液進行包裹，通過常規(guī)輸精方式對母豬實施單次輸精的一種技術，簡單地說就是把精子作為一個整體，外面包裹一層柔軟、可降解的聚合物膜，減少精子進入稀釋液。膠囊的柔軟度和直徑允許膠囊可通過普通的海綿導管，避免了常規(guī)人工授精一次性用品的使用，同時膠囊壁允許營養(yǎng)物質的進入和精子代謝廢物的排除，但精子表面的免疫活性分子卻不能通過膠囊壁;另外微膠囊材料的高分子聚合膜在不引起子宮黏膜副作用的情況下能夠黏附子宮膜，防止精液倒流，并可調節(jié)精子適時釋放。該技術不僅節(jié)約了大量的一次性輸精耗材，而且只需要對母豬進行單次輸精，減少了操作次數(shù)。目前，該項技術在控釋領域中已十分成熟。
2.2 精子微膠囊技術的原理及研究結果
在1985年，Nobel研究團隊最早提出精子微膠囊化的設想，他們運用多聚賴氨酸將牛精液進行微膠囊化，而后觀察發(fā)現(xiàn)微膠囊化的精子頂體完整性及精子活力令人滿意[7]。隨后的試驗結果表明，將豬的精子進行微膠囊化后，其具有較高比例的完整頂體，但在體外孵化8小時后僅有7%的精子具有活力，24小時后則幾乎完全喪失活力。
隨后，一種無支鏈多糖的藻酸鹽替代多聚賴氨酸成為豬精液微囊化的生物聚合材料。該藻酸鹽是由古羅糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)兩種酸縮合而成，有兩種存在形式，分別為均聚物(如-GGGG-或-MMMM-)和雜聚物(如-GMGMGMGM-)。古羅糖醛酸組成G單位，在軸向方向上聚合，構成硅酸鹽分子的囊結構，而這些囊結構通常會被二價或者三價離子(如Ca2+, Sr2+, Ba2+, Al3+)補充，構成了一個三維網(wǎng)絡水凝膠。水凝膠的機械特性由G/M比率(G單位相對強度大)和離子強度決定。Torre等人采用藻酸鈣作為包裹材料，對豬精子進行微膠囊化試驗[8]。具體步驟如下：向一份原精液(一次授精量，不稀釋)中逐滴加入5～25 mmol/L飽和氯化鈣溶液，再逐滴加入藻酸鈉并不斷攪拌。鈣離子立刻與藻酸鈉反應，導致藻酸鈣囊膜的形成。囊膜內部的鈣離子在藻酸膜中逐漸擴散，強化和加厚囊膜，形成一道囊膜墻。其結果表明，膠囊結構非常好，但精子活力受到較大影響[8]。隨后，Zhang等人提出用鋇離子取代鈣離子(圖4)，以避免由鈣離子引起的精子細胞膜超極化過程，從而避免了精子過早衰竭[9]。
Vigo等人在2002年研究發(fā)現(xiàn)，使用藻酸鋇膠囊化后1小時內的活精比例較高，其中試驗組膠囊內的活精比例為(86±12)%，參照組稀釋精液的活精比例為(97±6)%;膠囊化精子的結構完整性和受精能力均很好[10]。其試驗結果也證明了藻酸鋇膠囊能夠避免精子過早發(fā)生頂體反應。隨后，F(xiàn)austini等人在2004年時發(fā)現(xiàn)藻酸鋇膠囊化4小時后，保持在18℃下的膠囊內未發(fā)生頂體反應的精子顯著高于參照組(稀釋精液) (96% VS 85%)，膠囊化72小時后同樣顯著高于參照組(77% VS 55%);此外，在比較精子內關鍵抗氧化酶和膜維持酶的活性時，膠囊化72小時后精子內細胞色素氧化酶活性極顯著高于參照組[(14.9±1.6)VS(5.3±1.1)]，比較六磷酸葡萄糖脫氫酶和乳酸脫氫酶活性與細胞色素氧化酶時，結論也同上[11]。Faustini等人結果也證明將精清維持在一個封閉的微膠囊化生理環(huán)境中，不僅可以防止精清里的營養(yǎng)成分濃度降低，也可以更好地保存精子[12]。
在生產(chǎn)應用方面，Torre等人首先使用5 mmol/L藻酸鋇進行試驗，但母豬分娩率僅有25%(12頭母豬分娩4頭)，顯著低于傳統(tǒng)人工授精68.6%的分娩率(13頭母豬分娩9頭)，但在產(chǎn)仔數(shù)上沒有明顯的差異[(微膠囊化產(chǎn)仔數(shù)為(8.3±3.1)頭，傳統(tǒng)人工授精產(chǎn)仔數(shù)為(11.6±2.6頭)][13]。隨后，Huang等人報道通過藻酸鈣微膠囊精子后，在37℃保存條件下于8～32小時進行授精試驗，其結果顯示精子微膠囊授精試驗組豬的分娩率是75%(4頭母豬分娩3頭)，參照組傳統(tǒng)人工授精的分娩率則為100%(4頭豬全部分娩)[14]。Vigo等人于2009年進行大規(guī)模試驗(試驗母豬超過4 200頭)，試驗組用藻酸鋇對精子進行微膠囊化，精子劑量50億，僅授精1次;參照組常規(guī)人工授精，授精劑量50億精子，授精3次，最后結果顯示試驗組分娩率為96.5%，產(chǎn)仔數(shù)為(11.61±3)頭，參照組分娩率為93.1%，產(chǎn)仔數(shù)為(11.89±3)頭[15]。目前，精子微膠囊技術已經(jīng)成功應用到犬類動物身上，并能保持精子正常的受精能力達7天之久。
2.3 精子微膠囊技術的應用前景
精子的微膠囊技術是一項非常有前景的技術，它有助于實現(xiàn)對母豬單次人工授精并受孕的目的。精子的微膠囊化可以保證精子的完整性，減少精清營養(yǎng)成分的散失，防止精子過早發(fā)生超活化反應和頂體反應。未來該技術的研究主要是針對膠囊精子定時釋放、冷凍保存、膠囊化后的最小授精量及優(yōu)化設計。Anal等人在2007年時提出精子多重包裹法，應用多層膠囊對精子進行包裹以達到各時段釋放等量精子的效果[16](圖5a)。Kemmer等人在2011年報道他們設計促黃體生成素(LH)誘發(fā)的精子微膠囊生化電路技術，該膠囊主要根據(jù)母豬發(fā)情狀況時所產(chǎn)生的LH濃度定時釋放精子[17]。他們將能夠表達LH受體的細胞與精子細胞混合進行微膠囊化，LH受體能夠激活纖維素酶的表達并溶解膠囊壁(圖5b)。此外，Maxwell等人提出精子微膠囊與豬性別控制技術的聯(lián)用，通過單次輸精以減少輸精量并達到養(yǎng)豬生產(chǎn)上的性別控制[18]。Corcini等人最近針對該技術也提出一種新的處理精子方案，即向精液內添加明膠，用明膠包裹精子并提高精液內精子的完整性以及運動能力。試驗表明在明膠處理后96小時精液內正常精子比例顯著提高，此外明膠包裹的精液可以減慢人工授精后的精液回流[19]。
總之，精子微膠囊技術可以優(yōu)化豬的人工授精技術，最終達到人工授精單次操作，其未來將是豬繁殖技術新的轉折點。
